eläimet

Kaikki hiiret olivat testaushetkellä 3-11 kuukauden ikäisiä C57BL/6-uroksia. Hiiret ostettiin Jackson laboratorioista, ne säilytettiin lämpötilaltaan (22 °C) ja valoltaan kontrolloidussa tilassa, ja niille annettiin vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Hiiret lopetettiin isofluraanin yliannostuksella. Itä-Carolinan yliopiston laitosvalvontakomitea hyväksyi kaikki eläintoimenpiteet ja eläinten käytön. Eläinten hoito noudatti Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996).

FDB dissection

Kriittistä kaikille FDB:tä käyttäville toimenpiteille on huolellinen dissektio, joka estää lihaksen vahingoittumisen (lihaksen ympärillä on tiheän sidekudoksen alue) (ks. kuva 1). Leikkauksen helpottamiseksi varpaat kiinnitettiin korkkitauluun siten, että jalkaterä kiinnitettiin paikalleen siten, että jalkapohja oli ylöspäin. Seuraavaksi jalkaterän proksimaalisessa päässä (calcaneuksen yläpuolella) oleva iho puristettiin, jolloin mikrosaksilla voitiin tehdä viiltoja jalkaterän lateraalisia reunoja pitkin varpaisiin asti. Jalkaterän yläpuolella olevaa ihoa puristettiin edelleen, ja iho irrotettiin mikrosaksilla sen alla olevasta lihaksistosta. Jäljelle jäänyt iholäppä kuorittiin takaisin ja poistettiin, jotta varpaiden FDB ja jänteet saatiin näkyviin. Proksimaalinen jänne katkaistiin, ja kun jänteestä pidettiin kiinni pihdeillä, FDB leikattiin irti sen alla olevasta faskiasta. Varpaiden jänteet leikattiin sen jälkeen, jotta FDB saatiin irti jalkaterästä.

Myofibereiden eristäminen

FDB:n dissekoimisen jälkeen lihakset asetettiin tuoreeseen elatusaineeseen (DMEM, jossa on glutamiinia, 2 % steriilisti suodatettua FBS:ää, 0.1 % gentamysiini), jota täydennettiin 4 mg/ml kollagenaasi A:lla (Roche – 11088793001), 90-120 minuutiksi 37 °C:ssa 5 %:n hiilidioksidipitoisuudessa aiemmin kuvatulla tavalla . FDB-lihas asetettiin 2 ml:aan kasvatusmediaa, jossa ei ollut kollagenaasia, ja sitä trituroitiin varovasti astian seinämää vasten, jotta kuidut irtoaisivat nipusta käyttäen P1000-pipetin kärjen leikattua päätä. Eristetyt myokuidut kiinnitettiin lasipohjaisiin astioihin, jotka oli päällystetty entaktiini-kollageeni-laminiinilla (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore). Kuidut palautettiin 37 °C:n lämpötilaan 5 % CO2:ssa useiksi tunneiksi, minkä jälkeen ne kuvattiin jäljempänä kuvatulla tavalla.

FDB-lihassyiden pituus

Urospuolisten ja naaraspuolisten C57BL/6-hiirten FDB-lihakset sidottiin proksimaalisesta jänteestä ja kolmesta mediaalisesta varpaiden jänteestä silkkiompeleella ja kiinnitettiin metalliselle klipsaattorille lepojännityksen ylläpitämiseksi. Myofiberit eristettiin edellä kuvatulla tavalla, mutta niitä ei kiinnitetty lasipohjalevyihin. Myofiberit kuvattiin käyttämällä ×4-objektiivia ja EVOS XL -ydinmikroskooppia ja siihen liittyvää ohjelmistoa (Life Technologies, Bothell, WA). Noin 1000 myofiberin pituudet mitattiin ImageJ-ohjelmalla (versio 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). Eristettäessä myokuidut eivät olleet enää jännittyneitä, joten ne eivät edustaneet optimaalista pituutta. Tämän myofibereiden pituuden muutoksen huomioon ottamiseksi käytettiin muuntokerrointa, jossa käytettiin sarkomeerien pituutta, kuten tohtori Richard Lieber on aiemmin kuvannut. Optimaalisen pituuden ollessa optimaalinen hiirilihaksen sarkomeerin oletettu optimaalinen pituus on 2,5 μm poikki . Normalisoidaksemme myofibereiden pituudet sarkomeerin pituuteen mittasimme sarkomeerin pituuden 30 myofiberin osajoukosta. Kunkin myofiberin 10 sarkomeerin välinen etäisyys mitattiin, ja keskimääräinen sarkomeerin pituus laskettiin kaikkien 30 myofiberin osalta. Optimaalinen sarkomeerin pituus (2,5 μm) jaettuna keskimääräisellä mitatulla sarkomeerin pituudella tuotti muuntokertoimen 1,14, jota käytettiin kaikkien mitattujen myofiberien pituuksien normalisoimiseksi optimaaliseen sarkomeerin pituuteen.

Yksilöllinen kuitutyyppi ja kuitujen koko

FDB:n lihaskuitutyypin analyysi suoritettiin C57BL/6-hiirten näytteistä aiemmin kuvatulla tavalla . Leikkaukset tutkittiin ensisijaisilla vasta-aineilla myosiinin raskasta ketjua vastaan tyyppi I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) ja anti-dystrofiinia vastaan (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), minkä jälkeen ne kuvattiin EVOS FL -automikroskoopilla ja siihen liittyvällä ohjelmistolla (Life Technologies, Bothell, WA). Kuitutyyppi ja kuitujen poikkipinta-ala (CSA) arvioitiin ImageJ:n avulla, kuten aiemmin on kuvattu .

Isometrinen voimantuotto

Isometrinen voimantuotto ja väsymys arvioitiin C57BL/6-hiirten EDL- (n = 5), soleus- (n = 4) ja FDB- (n = 6) lihaksissa aiemmin kuvatulla tavalla pienin muutoksin. FDB paljastettiin ja proksimaalinen jänne kiinnitettiin silkkiompeleella. Hienokärkiset pihdit asetettiin varpaiden kolmen mediaalisen jänteen alle ja vedettiin varovasti alaspäin kohti varpaita, ennen kuin kaikki kolme jänteestä (kuva 1) kiinnitettiin silkkiompeleella. Sidoimme kolme mediaalista jännetä, koska anatomisesta sijainnista johtuen yhtä varpaista ei ole mahdollista sitoa, eikä neljännen jänteen sitominen kokemuksemme mukaan johda erilaiseen absoluuttiseen voimaan (tietoja ei ole esitetty). Tämän jälkeen kukin jänne katkaistiin juuri solmun yläpuolelta, ja FDB nostettiin varovasti pois jalasta. Jäljelle jäänyt sidekudos poistettiin mikrosaksilla ja irrotettiin jalasta. Lihas sidottiin sitten voima-anturiin ja ripustettiin hapetettuun Krebs Ringer -puskuriin (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) huoneenlämmössä. Lihaksen pituutta säädettiin sitten, kunnes FDB tuotti huippu nykäysvoiman, jolloin asetettiin optimaalinen lepojännitys (Lo) ja lihaksen annettiin tasapainottua 10 minuutin ajan. Soleus-lihakset valmisteltiin sitomalla kaksinkertainen neliösolmu distaaliseen soleus-jänteeseen. Jänne leikattiin solmun yläpuolelta, ja takimmaiset lihakset vedettiin varovasti pois jalasta paljastaen proksimaalisen soleus-jänteen, joka sidottiin kaksinkertaisella neliösolmulla. EDL leikattiin ja sidottiin aiemmin kuvatulla tavalla. EDL- ja soleus-lihakset tasapainotettiin hapellisessa huoneenlämpöisessä KRB:ssä lepojännityksessä 10 minuutin ajan. Tasapainotuksen jälkeen lihasjännitys optimoitiin suorittamalla maksimaalisia nykäysstimulaatioita ja säätämällä lihaksen pituutta, kunnes saavutettiin huippuvoima. Nykkäysstimulaatiot suoritettiin 30 sekunnin välein lihaksen väsymisen välttämiseksi. Lihaksia stimuloitiin sitten 60 sekunnin välein 10, 20, 40, 60, 80, 100 ja 120 Hz:n taajuudella voiman taajuuskäyrän luomiseksi. Lihakset lepäsivät vielä 1 minuutin ajan ennen 10 minuutin stimulaatioprotokollan suorittamista väsymiskestävyyden määrittämiseksi. Väsymisprotokollassa lihaksia stimuloitiin 30 Hz:n taajuudella 2 s:n välein 600 s:n ajan, yhteensä 300 supistusta. Lihasten optimaalinen pituus kirjattiin ja lihakset pyyhittiin ylimääräisen KRB:n poistamiseksi ennen punnitsemista. Optimaalinen 20 V:n jännite määritettiin ennen kokeita, jotta varmistettiin FDB:n, EDL:n ja soleuksen maksimaalinen stimulaatio (tietoja ei ole esitetty). Absoluuttiset lihasvoimatiedot muunnettiin spesifiseksi voimaksi (N/cm2) käyttäen aiemmin kuvattuja yhtälöitä lihaksen CSA:n ja fysiologisen poikkipinta-alan (PCSA) matemaattista arviointia varten. Ensisijainen ero CSA:n ja PCSA:n välillä on lihassyiden pituuden ja lihaksen pituuden suhteen sisällyttäminen PCSA-yhtälöön. Käytimme molempia korjattuja menetelmiä tarjotaksemme laajemman yhteensopivuuden kirjallisuuden kanssa.

Passiiviset supistumisominaisuudet

Passiiviset supistumisominaisuudet arvioitiin C57BL/6-uroshiirten EDL- ja FDB-lihaksissa (n = 4) aiemmin kuvatulla tavalla , pienin muutoksin. EDL- ja FDB-lihakset leikattiin ja sidottiin voima-anturiin edellä kuvatulla tavalla. Lihakset tasapainotettiin 10 minuutin ajan hapellisessa KRB:ssä huoneenlämmössä. Tasapainottamisen jälkeen lihasjännitys optimoitiin suorittamalla maksimaalisia nykäisyärsykkeitä ja säätämällä lihaksen pituutta, kunnes saavutettiin huippuvoima. Nykkäysstimulaatiot suoritettiin 30 sekunnin välein lihaksen väsymisen välttämiseksi. Lihaksen vertailupituus mitattiin Lo:na ennen passiivista venytystä, joka oli 105, 110, 115, 120, 125 ja 130 % Lo:sta. Lihakset pyyhittiin ylimääräisen KRB:n poistamiseksi ja punnittiin. Tiedot korjattiin CSA:n ja PCSA:n suhteen.

Kardiotoksiini (CTX) -vaurio

Vertailu tehtiin C57BL/6-hiirillä CTX:llä käsitellyn FDB:n (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) ja PBS:llä käsitellyn kontralateraalisen FDB:n välillä 4 vuorokautta (n = 4) ja 10 vuorokautta jälkikäteen tapahtuneen käsittelyn jälkeen (n = 2). Steriilit 8 mm:n pituiset 31G-ruiskut valmistettiin 10 μl:lla 10 μM CTX:ää tai 10 μl:lla steriiliä 1 × PBS:ää, kuten aiemmin on kuvattu . Isofluraanin aiheuttaman anestesian jälkeen neljän hiiren jalkapohja puhdistettiin alkoholipyyhkeillä. CTX ruiskutettiin jalkaterän proksimaaliseen osaan siten, että neula asetettiin ihon alle ja kohti varpaita. Kontralateraaliseen jalkaan ruiskutettiin PBS:ää. Hiiret uhrattiin sopivana ajankohtana, ja FDB:t leikattiin irti voimantuoton mittaamista varten edellä kuvatulla tavalla. Tiedot korjattiin PCSA:han.

Hematoksyliini- ja eosiinivärjäys

FDB-lihakset, joille oli annettu 10 päivän CTX-hoito, pakastettiin optimaalisessa leikkauslämpötilaliuoksessa OCT-liuoksessa leikkelemistä ja H&E-värjäystä varten aiemmin kuvatulla tavalla.

Luustolihaksen korkean resoluution mitokondrioiden respirometria

Permeabiloitujen gastrocnemius- ja FDB-lihaksen kuitukimppujen valmistaminen

Respirometria suoritettiin eristetyille permeabiloiduille gastrocnemius- ja FDB-lihaksen lihaksen kimpuille, jotka oli leikattu pois samasta raajasta C57BL/6-hiiristä (n = 4). Osa punaisesta gastrocnemiuksesta leikattiin ja sitä käytettiin permeabiloitujen kuitukimppujen valmistukseen aiemmin kuvatulla tavalla. Vertailukudoksena käytettiin punaista gastrocnemius-lihasta, koska sitä käytetään yleisesti hiirten luurankolihaksen mitokondriohengityksen arviointiin. Protokolla permeabiloitujen FDB-lihaksen kuitukimppujen valmistamiseksi mukautettiin aiemmin kuvatuista punaisen gastrocnemius-lihaksen kuitukimppujen permeabilointimenetelmistä, ja se esitetään jäljempänä. FDB:t leikattiin ja lisättiin välittömästi jääkylmään puskuriin X (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidatsoli, 20 tauriini, 5,7 ATP, 14,3 fosfokreatiini, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). Sidekudos, rasva ja verisuonet poistettiin varovasti leikkelymikroskoopin avulla lihaksen häviämisen välttämiseksi. FDB:t leikattiin nipuiksi ja jaettiin kolmen tai neljän nipun ryhmiin, jotka painoivat 1,5-2,0 mg märkäpainoa. Tämän jälkeen nippuryhmät permeabiloitiin puskurissa X, joka sisälsi 22,5 μg/ml saponiinia, jatkuvassa pyörityksessä 4 °C:ssa 5 minuutin ajan. Lihaskimput siirrettiin välittömästi jääkylmään puskuriin Z (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) ja pestiin jatkuvalla pyörimisellä 4 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Mitokondrioiden hengitys

O2:n kulutuksen korkearesoluutioiset mittaukset tehtiin OROBOROS Oxygraph-2K -laitteella (Oroboros Instruments, Innsbruck, Itävalta) 37 °C:n lämpötilassa, kun hapen lähtökonsentraatio oli ~ 300-350 μM aiemmin kuvatulla tavalla . Kokeet tehtiin puskurissa Z, joka sisälsi 20 mM kreatiinimonohydraattia ja 25 μM blebistatiinia. Mitokondrioiden hengitystä arvioitiin lisäämällä peräkkäin substraatteja, joiden lopullinen pitoisuus oli pyruviitti 4 mM, malaatti 0,5 mM, glutamaatti 5 mM, ADP 2.5 mM, sukkinaatti 5 mM, sytokromi c 5 μM, rotenoni 10 μM, antimysiini A 5 μM, askorbiinihappo 2 mM ja TMPD 0,5 mM (N,N,N′,N′-tetrametyyli-p-fenyleenidiamiinidihydrokloridi). Mitokondriokalvon eheys varmistettiin sulkemalla pois gastrocnemius- ja FDB-lihaskimput, joiden hengitys lisääntyi > 10 tai > 20 prosenttia eksogeenisen sytokromi c:n lisäämisen jälkeen. Eri poissulkukriteerejä käytettiin gastrocnemius- ja FDB-lihaskimppuihin, koska alustavat testit osoittivat, että FDB-kuitukimppuihin verrattuna gastrocnemius-kuitukimppuihin hengityksen suurempi prosentuaalinen lisäys oli yleistä sytokromi c:n lisäämisen jälkeen. Protokollaa päätyttyä lihaskimput huuhdeltiin tislatulla H2O:lla, pakastekuivattiin (Labconco, Kansas City, MO) ja punnittiin (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Ehjien gastrocnemius-lihaskimppujen hengitysnopeudet korjataan yleisesti kuivapainoon; näiden kahden lihasryhmän sidekudospitoisuuden erojen vuoksi JO2-arvot korjattiin kuitenkin myös kokonaisproteiiniin ja sitraattisyntaasin (CS) aktiivisuuteen. CS-aktiivisuus mitattiin CS0720-sarjalla. Kemikaalit ja reagenssit ostettiin Sigma Aldrichilta.

Mikroskopia

In vitro

FDB-lihassyyt eristettiin C57BL/6-hiiristä ja kiinnitettiin 35 mm:n lasipohjaisiin astioihin, jotka oli päällystetty ECL:llä, kuten aiemmin on esitetty. Eristetyt myofiberit värjättiin mitotracker deep redillä (M2246, Thermo Fisher) ja NucBlue (R37605, Thermo Fisher) DMEM:ssä 30 minuutin ajan. Kuidut pestiin kolme kertaa 2 ml:lla KRB:tä. Kuidut kuvattiin yhden fotonin konfokaalisella laserkeilausmikroskoopilla, jossa oli ×60 öljyimmersio-objektiivi (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35), ja heräte saatiin aikaan käyttämällä monilinjaisen argonlaserin 405 ja 488 nm:n linjoja.

In vivo

Toisen harmonisen harmonisen sukupolven syntyminen kuvaa optista vaikutusta, joka syntyy laserpulssin kulkiessa vahvasti polarisoituneiden, ei-keskipisteen kaltaisten, ei-keskipisteen kaltaisten, symmetristen materiaalien, kuten myosiinin, läpi. Kun nämä materiaalit on polarisoitu sopivalla aallonpituudella, ne säteilevät valoa puolet tulon aallonpituudesta, mikä tuottaa korkearesoluutioisia kuvia ilman fluoresoivia koettimia, jotka altistuvat fotobleachingille ja fototoksisuudelle. Lisäksi käytetyt lähi-infrapunan aallonpituudet mahdollistavat syvän kudoksen tunkeutumisen ilman invasiivisia toimenpiteitä. C57BL/6-hiiret nukutettiin ennen kuin FDB:tä peittävä iho poistettiin, jolloin FDB-lihas paljastui. Kun FDB oli paljastunut, se nesteytettiin steriilillä KRB:llä ja hiiri asetettiin makuuasentoon lasiselle peitelevylle (#1.5, Leica) aiemmin kuvatulla tavalla (kuva 1C). Myosiinia ja nikotiiniamidia sisältäviä molekyylejä herätettiin 900 ja 720 nm:ssä moodilukitulla Ti:Sapphire-pulssilaserilla (Mai Tai Deep See HP-sarja, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), ja emissio rekisteröitiin käyttämällä ei-deskannattua detektiota FV10 MRV/G-suodattimella, joka oli asetettu 450 ja 420 nm:iin. Kaikki kuvat otettiin ×60 öljyimmersio-objektiivilla (Plan Apochromat, NA 1,35) ja Olympus FV1000 LSM -laitteella, jossa käytettiin FV10-ASW 4.2 -kuvausohjelmistoa.

cDNA:n elektroporaatio ja korkean resoluution respirometria luurankolihaksesta, joka yliekspressoi Pgc1α

CDNA:n elektroporaatio FDB:hen tehtiin aiemmin kuvatulla tavalla . Lyhyesti sanottuna seitsemän nukutetun C57BL/6 uros- ja naarashiiren jalat puhdistettiin alkoholipyyhkeellä ja jalkapohjiin ruiskutettiin 10 μl 2 mg/ml hyaluronidaasia, joka oli suspendoituna steriiliin suodatettuun KRB:hen, 8 mm:n pituisella 31-mittaisella steriilillä neulalla. Noin 1 h myöhemmin hiiret nukutettiin toisen kerran. Jalat puhdistettiin jälleen alkoholipyyhkeellä ja toinen jalka sai 30 μg vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) merkityn PGC1α-plasmidin ja kontralateraalinen jalka injektoitiin YFP cDNA:lla. Kun hiiret olivat täysin toipuneet nukutuksesta, ne nukutettiin kolmannen kerran ~ 10 minuuttia myöhemmin. Platinaelektrodit työnnettiin ihon alle ja sijoitettiin kohtisuoraan FDB:hen nähden ja yhdensuuntaisesti toisiinsa nähden kantapäähän ja jalkaterään varpaiden alapuolelle. FDB:tä stimuloitiin 20 pulssilla, joiden kesto oli 20 ms, 1 Hz ja 100 V . Hiiret teurastettiin 14 päivää myöhemmin, ja FDB:t leikattiin ja kuvattiin fluoresoivalla mikroskoopilla plasmidiekspression vahvistamiseksi. Tämän jälkeen valmistettiin ehjät FDB-lihasnäytteet ja mitattiin mitokondriohengitys edellä esitetyllä tavalla.

Tilastot

Tietojen jakaumat arvioitiin, ja tiedot, jotka eivät vastanneet normaalijakaumaa, muunnettiin log-perus 10:een. Voiman taajuuden supistumistiedot analysoitiin kaksisuuntaisella ANOVA:lla, jossa oli Tukeyn moninkertaiset vertailut. Lihasmassaa, kuitutyyppiä, maksimi- ja puolirentoutumisaikaa sekä väsymystietoja analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jossa oli Tukeyn moninkertaiset vertailut. Tapauksissa, joissa tietoja ei voitu muuntaa normaalijakauman mukaisiksi, suoritettiin Kruskal-Wallisin testi Dunnin moninkertaisilla vertailuilla. ANOVA-analyysit tehtiin GraphPad Prism 7.03 -ohjelmalla. Hengitystietoja ja CS-aktiivisuutta analysoitiin parittaisilla kaksoissuuntaisilla t-testeillä, joiden alfa-taso oli 0,05, Microsoft Excelin avulla. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM.