Hiilimäisten homeiden tunnistaminen rutiininomaisessa kliinisessä laboratoriossa perustuu edelleen pääasiassa sporuloivien pesäkkeiden mikroskooppiseen tutkimiseen. Sieniä, joilta puuttuvat sporokarpit tai tyypilliset itiöt, on vaikea tunnistaa (Pounder ym. 2007; Santos ym. 2013). Tässä tutkimuksessa analysoitiin 13 steriiliä tai diagnosoimatonta kantaa. Fenotyyppisten piirteiden perusteella isolaatit tunnistettiin Papulaspora-lajeiksi, koska ne muodostivat rykelmiä tai sipulimaisia rakenteita (Vinod Mootha ym. 2012). Kun sporulaatiota yritettiin indusoida erilaisilla substraateilla ja inkubaatio-olosuhteilla, jotkin kannat tuottivat pieniä konidioita lyhyillä phialideilla, mutta silti nämä konidiat eivät olleet diagnostisesti käyttökelpoisia eikä niitä voitu käyttää lajinmääritykseen.

Kuuden lokuksen molekyyli- ja fylogeneettisen analyysin avulla havaittiin, että kannat kuuluivat kolmeen uuteen lajiin, jotka on kuvattu tässä tutkimuksessa. Kaksi lajia klusteroitui Subramaniula-suvun tyyppilajin kanssa, kun taas yksi oli kahden kuvatun Chaetomium-lajin sisar. Sekä Subramaniula että Chaetomium kuuluvat Chaetomiaceae-sukuun (Sordariales). Tämän suvun jäsenille on ominaista askosporien muodostuminen deliquenttisiin askeihin enemmän tai vähemmän laajasti koristeltujen perithecioiden sisälle (Whiteside 1961). Chaetomiaceae-heimon lajien fenotyyppinen tunnistaminen riippuu enimmäkseen ascomatal-karvojen muodosta, ascoma-pigmentaatiosta ja -koristelusta sekä ascosporeiden muodosta (Ames 1961; von Arx et al. 1984). Tässä tutkimuksessa kuvatuilla kolmella lajilla oli epätavallisia morfologisia piirteitä, koska ne eivät pystyneet muodostamaan sukupuolisia lisääntymismuotoja ascomatassa. Sen sijaan esiintyi paksuseinäisten, tummien pigmenttisolujen klustereita. On epäselvää, edustivatko nämä rakenteet epäkypsiä perithekioita (Davey ym. 2008). Sienten singulaarisen nimikkeistön puitteissa (Taylor 2011) lajit kuvataan tässä kuitenkin sukupuolisukuina niiden fylogeneettisen aseman perusteella Chaetomiaceae-suvussa.

Kaksi uutta Subramaniulan kanssa klusteroituvaa lajia olivat peräisin kliinisistä lähteistä, useimmiten silmä- tai ihoinfektioista. Koprofiilinen Subramaniula-suku tunnetaan tällä hetkellä kahdesta lajista, jotka on siirretty Achaetomiumista, eli S. irregularis ja geneerinen tyyppilaji S. thielavioides (Cannon 1986; von Arx 1985; von Arx ym. 1978). Subramaniula-suvulle on ominaista kalju vaalea ascomata, jossa on leveät apikaaliset aukot (kuva 8), ilman tunnettua suvutonta muotoa. Cannon (1986) raportoi ”muutamista hyfoista, joissa on huomattavasti turvonneiden solujen ketjuja, jotka tuottavat ohutseinäisiä pallomaisia tai ellipsinmuotoisia kappaleita, joiden läpimitta on enintään 8 μm, mutta jotka eivät ehkä toimi lisääntymiskykyisinä”. Jotkut kirjoittajat ehdottivat, että nämä kappaleet saattavat liittyä tämän sienen suvuttomaan tilaan (Pastirčák ja Pastirčáková 2009). Tutkittaessa S. thielavioidesin ex-tyypin kantaa (CBS 122.78) havaittiin turvonneiden solujen ketjuja, mutta ohutseinäisiä elimiä ei näkynyt. Verrattuna kahteen uuteen Subramaniula-lajiin, joissa havaittiin konidioita, nämä rakenteet eivät todennäköisesti ole konidioita, vaan ne voivat toimia eloonjäämislevitteinä. Subramaniula irregularis (syn. Achaetomiella irregulare) on kuvattu morfologisesti samankaltaiseksi kuin S. thielavioides, mutta askosporien muodossa ja koossa sekä ascomatan pigmentaatiossa on joitakin eroja, mutta tästä lajista ei ole saatavilla elävää viljelyä (Cannon 1986).

Subramaniula thielavioides (CBS 122.78). Pesäkkeet 1 viikon inkubaation jälkeen: a-b MEA etu- ja takapuoli; c OA; d Ascomata; e Ascomata seinämä; f-h Ascospores. – Mittakaavapalkit = 10 μm

Subramaniula thielavioides on eristetty lantanäytteestä Intiasta, kun taas S. irregularis tunnetaan vain Etelä-Afrikan maaperästä (Cannon 1986; von Arx ym. 1978). Toistaiseksi Subramaniulan ei ole todettu aiheuttaneen yhtään ihmistartuntaa. Cannon (1986) raportoi kuitenkin S. thielavioides -bakteerin eristämisestä ihmisen kynsistä, ja mielenkiintoisesti hän totesi, että ”lääketieteen mykologien pitäisi olla tietoisia sen olemassaolosta”. Kahden äskettäin kuvatun kliinisen lajin myötä Subramaniula-suvun on vahvistettu olevan opportunistinen suku, joka voi aiheuttaa iho-, silmä- ja kynsi-infektioita. Vinod Moothan ja muiden (2012) julkaisema tunnistamaton kanta sarveiskalvon haavaumasta, CBS 123294, kuvataan tässä tutkimuksessa uudeksi Subramaniula asteroides -lajiksi. Kanta saatiin talteen potilaasta, jolla oli piilolinssi ja joka oli loukkaantunut rautalangalla työskennellessään hevostallilla. Kanta dH 21571 koski keratiittia, joka syntyi terävällä kasvinlehdellä saadun silmävamman jälkeen maatalouspellolla trooppisessa Intiassa. Kaksi muuta Yhdysvalloista peräisin olevaa kantaa oli myös peräisin sarveiskalvon haavaumista. Kaksi muuta Espanjassa silmätulehduksista saatua kantaa sopivat yhteen S. asteroidesin kanssa; CNM-CM 4314 eristettiin 27-vuotiaan miespotilaan sarveiskalvon eritteestä, ja CNM-CM 7482 oli peräisin 47-vuotiaan immuunipuutteisen potilaan endoftalmitiitista; lasiaisnesteessä havaittiin hyytymiä, ja potilas menetti silmänsä. Subramaniula asteroidesilla näyttää siis olevan vahva yhteys traumaattisiin silmäinfektioihin. Tämän tutkimuksen aikana myös toinen sekvenssi, joka oli peräisin erään Saudi-Arabiasta kotoisin olevan potilaan iholta saadusta isolaatista (UTHSC 03-1315), tunnistettiin S. asteroidesiksi. Myös ainoa S. asteroidesin ympäristöisolaatti oli peräisin Saudi-Arabiasta, nimittäin hiekkaisesta aavikkomaasta hiilivetyjen vaikutuksesta. Se saatiin talteen tolueenirikastuksella (Zhao ym. 2010), joka on menetelmä, joka on suunniteltu myrkyllisissä olosuhteissa kasvavien sienten eristämiseen.

Subramaniula obscura kuvataan tässä artikkelissa yhdestä ainoasta kannasta 53-vuotiaalta kuwaitilaiselta mieheltä, jolla oli varvasinfektio. Kanta tunnistettiin alun perin Chaetomium cuniculorumiksi. Havaitsimme, että C. cuniculorum -kannat ovat fylogeneettisesti sukua S. obscuralle, sillä molemmat löytyivät yhdestä ainoasta tuetusta kladista sekä ribosomigeenianalyysin (ML-BS/PP, 84 %/1,0) että proteiineja koodaavien geenien multilokusanalyysin (ML-BS/PP, 100 %/0,99) perusteella (kuva 2). ITS-sekvensoinnin avulla ja käyttämällä rajoitettua määrää taksoneita näiden kahden lajin erottaminen toisistaan saattaa todellakin olla vaikeaa. S. obscuran ex-tyyppikannan CBS 132916 ITS-sekvenssi osoitti 97 prosentin samankaltaisuutta C. cuniculorum -isolaattien kanssa. Jälkimmäisen lajin uskotaan esiintyvän pääasiassa lannassa, ja noin puolet CBS:n viljelykokoelmassa säilytetyistä C. cuniculorum -kannoista on peräisin kasvinsyöjäeläinten lannasta. S. obscuran ITS:n samankaltaisuus S. thielavioidesin kanssa on 99,4 %, mutta proteiineja koodaavat geenit ovat johdonmukaisesti erilaisia, ja siksi uuden lajin kuvaaminen Subramaniulaan on perusteltua.

Subramaniula obscuran makro- ja mikromorfologia on samankaltainen kuin S. asteroidesin, lukuun ottamatta sitä, että solut, jotka muodostavat S. obscuran rykelmiä, ovat ruskehtavammat ja pyöristyneemmät ja että hyfat ovat paksumpia, ja niissä on syyliä muistuttavia ulkonemia. Molempien lajien ja S. thielavioides -lajin pienin kasvulämpötila on 6 °C, ja ne kaikki kasvoivat hyvin yli 40 °C:n lämpötilassa, mikä osoittaa Subramaniula-lajien lämpösietokykyä. Optimaalinen kasvu oli 33-36 °C:n välillä, ja johdonmukainen selviytyminen 37 °C:ssa osoittaa kykyä kasvaa ihmisen ruumiinlämmössä virulenssitekijänä (Revankar ja Sutton 2010).

Henkilön vatsakalvotulehduksesta talteen saadun Chaetomium anamorphosum-kannan CBS 137114 tunnistaminen uudeksi lajiksi tehtiin aluksi morfologisen vertailun perusteella kuvattuihin Papulaspora-lajeihin. Tämä kanta oli jossain määrin samankaltainen Papulaspora nishigaharanas -lajin kanssa, sillä se muodosti ruskean väristen, paksuseinäisten solujen aggregaatteja ja tuotti fialokonidioita (Watanabe 1991). GenBankissa olevien ITS- ja 28S rRNA-geenin D1/D2-alueen sekvenssien vertailu ei paljastanut homologisuutta minkään tunnetun sekvensoidun lajin kanssa. Molekyylifylogeneettisen lähestymistavan avulla pystyimme ratkaisemaan tämän isolaatin taksonomian lähisukulaiseksi askosporulaattilajeille Chaetomium irregulare ja C. fusisporum (kuvat 1, 2 ja 9). Äskettäin tunnistettu laji erosi C. irregulare- ja C. fusisporum -lajeista paitsi morfologian myös kasvulämpötilan suhteen. C. anamorphosum -lajin optimaalinen kasvulämpötila oli 33-36 °C, ja kasvua havaittiin vielä 40 °C:ssa, kun taas C. irregulare -lajin optimaalinen kasvulämpötila oli 30 °C, eikä se pystynyt kasvamaan tai kasvoi vain heikosti 40 °C:ssa. Chaetomium irregulare siirrettiin Achaetomium-sukuun Rodríguez et al. (2004) mukaan. Kun sitä kuitenkin verrattiin sukutyyppiin Achaetomium globosum, se todettiin etäiseksi, ja nimi Achaetomium irregulare on tarpeeton. Uutta lajia ja muita Chaetomium spp. sisältävän, Subramaniulan kanssa parafyleettisen kladin taksonomia ja nimistö ovat epäselviä, koska etäisyys geneeriseen tyyppilajiin, C. globosumiin, on suhteellisen suuri. Lisäksi tämän kladin lajien ascomata-, ascomatal-karvojen (jos niitä on) ja ascosporien morfologia eroaa C. globosum -lajin morfologiasta. Chaetomium-, Achaetomium-, Subramaniula- ja Achaetomiella-suvut olivat morfologisesti samankaltaisia, ja niissä oli vain vähän eroja askomatakarvojen esiintymisessä ja puuttumisessa, askooman seinämässä, askosporien värissä ja kasvunopeudessa (Cannon 1986). Molekyylitietojen saatavuuden myötä nämä merkit ovat menettäneet suurelta osin merkityksensä. Chaetomiumin taksonomista tarkistusta odotellessa säilytämme nykyisen luokittelun tämän suvun sisällä ja tunnustamme Subramaniulan Chaetomiumin sisällä pesiväksi suvuksi.

Chaetomium irregulare (CBS 446.66). Pesäkkeet MEA:lla: a Yksi viikko b Neljän viikon inkubaatio; c Asci OA agarin pinnalla; d Ascomata; e Ascomata seinämä; f-g Asci; h. Ascospores. – Mittakaavapalkit = 10 μm

Huolimatta Chaetomiumin ja sen sukulaisten suuresta määrästä kuvattuja lajeja, niiden molekulaarisesta taksonomiasta tiedetään vain vähän, ja vain harvat lajit on sekvensoitu ja saatavilla julkisissa tietokannoissa (Wang ym. 2014). Suurin osa aiemmista tutkimuksista rajoittui harvinaisiin lajeihin, ja yleisempien Chaetomium-lajien fylogenia on edelleen ratkaisematta (Asgari ja Zare 2011; Lee ja Hanlin 1999; Wang ym. 2014). Äskettäin kuvattiin kolme uutta C. indicum -ryhmän lajia neljän geenin molekyylianalyysin perusteella (Wang ym. 2014). Toinen Chaetomiumin molekyylitutkimus oli Asgarin ja Zaren (2011) Iranissa tekemä tutkimus, jossa käytettiin kolmen geenin fylogeneettistä analyysia ja jonka tuloksena rajattiin kuusi uutta lajia. Näistä kahdella oli samankaltaisia suvuttomia morfologioita kuin Chaetomium anamorphosumilla ja molemmilla tässä artikkelissa kuvatuilla Subramaniula-lajeilla. Chaetomium rectangulare Asgari ja Zare (2011) kuuluu C. globosum -ryhmään, jolle ovat ominaisia suvuttomat muodot, joiden phialidit ja konidit ovat hyvin samankaltaisia kuin meidän uuden lajimme. Tämä saattaa viitata siihen, että uudet lajit ovat jotenkin menettäneet kykynsä muodostaa suvullisia hedelmiä ja korvanneet sen suvuttomalla itiötyypillä. Sukupuolista lisääntymistä säätelevän MAT-lokuksen sekvensointi saattaisi osoittaa, puuttuuko näissä lajeissa sukupuolimorfi vai onko se tukahdutettu.

Lemmikkieläinten lanta, hajoava kasviaines ja maaperä ovat tunnettuja Chaetomium-, Subramaniula- ja Papulaspora-lajien luonnollisia elinympäristöjä. De Hoog et al. (2013b) huomasivat, että Madurella-suku pesii Chaetomium-suvun sisällä ja että monissa Chaetomiaceae-suvun lajeissa lanta-assosiaatio yhdistyy kuiviin ilmasto-olosuhteisiin. Kun Chaetomiumiin lisätään aiemmin tunnistamattomat ei-askosporuloivat lajit, tämän suvun merkitys ihmisten ja eläinten sairauksissa on kasvanut merkittävästi. Chaetomium-infektioita ja Chaetomium-fylogeneettisessä puussa ryhmittyvien lajien, kuten Chaetomidiumin ja Thielavian, aiheuttamia infektioita on raportoitu iholta, hiuksista ja kynsistä (Hubka ym. 2011; Kaliamurthy ym. 2011; Najafzadeh ym. 2014; Vinod Mootha ym. 2012). Lisäksi useiden Chaetomiaceae-lajien on raportoitu aiheuttavan vakavia opportunistisia infektioita immuunipuutteisilla potilailla (Al-Aidaroos ym. 2007; Guppy ym. 1998; Hoppin ym. 1983). Useita C. anamorphosum -tartunnan kaltaisia vatsakalvotulehdustapauksia on raportoitu immuunipuutteisilla henkilöillä, jotka olivat saaneet tartunnan peritoneaalidialyysin aikana. Febré ja muut (1999) eristivät C. globosumin dialyysinestepulloista; peritoniitin raportoivat Baer ja muut (2013). Issa et al. (2013) julkaisema mielenkiintoinen tapaus koski tuntemattoman Chaetomium-lajin aiheuttamaa vatsakalvotulehdusta immunokompetentilla naisella Damamista, Saudi-Arabiasta. Ilmeisesti myös immunokompetentit henkilöt ovat vaarassa saada Chaetomiumin tai siihen liittyvien sienien aiheuttamia syviä infektioita. Esimerkiksi Thielavia subthermophilan aiheuttamasta kuolemaan johtaneesta aivofomykoosista on raportoitu tapaus immunokompetenteilla henkilöillä (Badali ym. 2011). Chaetomium atrobrunneum, C. perlucidum ja C. strumarium katsottiin nyt neurotrooppisiksi lajeiksi, jotka aiheuttavat vakavia ja hengenvaarallisia infektioita (Abbott ym. 1995; Barron ym. 2003; Guppy ym. 1998). Näyttää siltä, että Chaetomiaceae-suvun jäsenillä on todellakin aliarvioitu kliininen potentiaali, ja suvun roolin uudelleenarviointi ihmisen patologiassa on kiireellisesti tarpeen. Monien lajien luontainen elinympäristö kuivassa ilmastossa ja niiden selviytyminen korkeista lämpötiloista parantavat todennäköisesti niiden selviytymistä nisäkkäiden kudoksissa. C. anamorphosumin kyky kasvaa optimaalisesti 36 °C:ssa, toisin kuin C. irregulare, on tästä hyvä esimerkki. Lajit kykenevät rikkomaan ihmiskehon lämpösulkuvyöhykkeen, ja jos kyseessä on immunosuppressio tai muu immunologinen ongelma, sienet voivat nousta potentiaalisiksi ihmisen patogeeneiksi (Casadevall 2012).

Fenotyyppisiin kriteereihin perustuvien tunnistamisvaikeuksien vuoksi jotkin vanhemmat tapaukset, joissa on esiintynyt Chaetomium- tai Subramaniula-lajeja, on saatettu virheellisesti jättää huomioimatta tai ne on raportoitu tapauksina, joissa on ollut kyse Madurella- tai Papulaspora-infektiosta (Mohd-Tahir ym. 2012). Tutkimuksemme osoittavat selvästi, että chaetomiumin kaltaisten lajien aiheuttamat traumaattiset ja opportunistiset infektiot tuottavat usein viljelyssä ei- tai heikosti sporuloivia kantoja (Najafzadeh ym. 2014; Vinod Mootha ym. 2012). Näiden kantojen kuvaaminen erillisinä taksonomisina kokonaisuuksina suvussa on merkittävää sekä kliinisestä että epidemiologisesta näkökulmasta. Lisäksi sieniherkkyystutkimukset ovat vähäisiä, ja hoitoprotokollia tarvitaan kiireellisesti.