Participantes humanos

Los experimentos en España fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética del Hospital Universitario La Fe de Valencia y se adhirieron a los principios de la Declaración de Helsinki y otras revisiones. Los experimentos realizados en Berlín fueron aprobados por el comité ético de la Charité-Universitätsmedizin de Berlín (EA4/012/05). Se estudiaron dos cohortes: una consistía en 65 voluntarios adultos sanos y otra en 16 pacientes con síndrome de Usher (tipo II) portadores de diferentes mutaciones de truncamiento en USH2A. Se omitieron los datos de tres pacientes del presente estudio debido a que dos de ellos tenían un diagnóstico previo de diabetes y un paciente con síndrome del túnel carpiano, que podría afectar a los umbrales psicofísicos. Los participantes en el estudio fueron sometidos a una batería de nueve pruebas psicofísicas aplicadas en la piel. Todos los participantes recibieron información escrita y oral antes de participar en el estudio y dieron su consentimiento por escrito. Ninguno de los participantes en el estudio tenía una edad <20 años. Se documentó la siguiente información de los participantes: edad, sexo, lateralidad, dispositivos auditivos (audífonos, implantes cocleares), gravedad de los síntomas de sordera y ceguera, y comorbilidades.

Pruebas sensoriales cuantitativas humanas

Las pruebas psicofísicas se realizaron de acuerdo con el protocolo de pruebas estandarizado de las pruebas sensoriales cuantitativas de la Red Alemana de Investigación sobre el Dolor Neuropático44. Los umbrales de percepción vibrotáctil a diferentes frecuencias se determinaron mediante un ensayo de dos opciones1,2. El dispositivo estaba compuesto por un actuador piezoeléctrico lineal (Physik Instrumente, número de catálogo P-602.1 L), cuyos desplazamientos son accionados y controlados por un amplificador/controlador (Physik Instrumente, número de catálogo E-665). Las señales fueron procesadas por el sistema de adquisición de datos PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). El estímulo de vibración tenía una duración de 1,8 s y el tiempo de subida y bajada al inicio y al final era de 500 y 600 ms, respectivamente, independientemente de la frecuencia o la amplitud de la prueba. La duración del estímulo entre las fases de inicio y desplazamiento fue de 700 ms. Se empleó un conjunto de estímulos de vibración de escala logarítmica entre 18 nm y 45 μm. Para los ensayos de vibración de 10 Hz y 125 Hz, la amplitud inicial se fijó en 7,18 μm y 2,84 μm, respectivamente. No medimos directamente el movimiento de la sonda en las condiciones de ensayo utilizadas. Este actuador piezoeléctrico muestra una alta fidelidad, pero la atenuación de la amplitud podría producirse teóricamente con desplazamientos de mayor amplitud cerca de la amplitud máxima de desplazamiento del actuador (35 µm). Sin embargo, todos los participantes mostraron umbrales psicofísicos muy por debajo de 35 µm para todas las frecuencias probadas (Fig. 1c). Nótese que se utilizó exactamente el mismo aparato para la medición en los controles sanos y en los participantes con síndrome de Usher. Los estímulos de vibración mecánica se aplicaron a la piel entre el lecho ungueal y la primera articulación del dedo meñique. La sonda era de vidrio y tenía un área de contacto circular plana de 5 mm de diámetro con un contrapeso de latón para garantizar que se aplicara el mismo grado de fuerza de sujeción en todos los participantes. Se probó el dedo meñique de la mano dominante en dos frecuencias (10 Hz y 125 Hz; 1,8 s de duración). Los participantes señalaron la detección de un estímulo vibratorio durante una de las dos ventanas de tiempo pulsando un botón. El protocolo consistía en un diseño arriba-abajo que aumentaba o disminuía la amplitud del estímulo (entre 18 nm y 45 µm), dependiendo de la tasa de éxito durante la tarea. Se realizaron ocho inversiones de amplitud arriba-abajo (un total de ~40-80 ensayos individuales por sesión) alrededor del umbral perceptivo para crear un umbral perceptivo medio para cada paciente. La amplitud de los estímulos de vibración impulsados por el dispositivo piezoeléctrico se calibró midiendo la amplitud de desplazamiento de la sonda bajo un microscopio a incrementos de tensión escalonados.

También se utilizó una prueba de agudeza táctil para comprobar los límites de la resolución espacial de la yema del dedo (inervación mediana), utilizando una prueba de orientación de rejillas táctiles de dos intervalos, de elección forzada, con un cubo de agudeza táctil, que constaba de seis lados con rejillas de diferentes anchos (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 y 6,0 mm)1,2,3. Los participantes tenían los ojos vendados y el cubo se colocaba en orientación vertical u horizontal contra la yema del dedo. Se empleó un procedimiento de dos hacia abajo y uno hacia arriba con 10-15 puntos de giro del tamaño de la rejilla. Los umbrales (71% de respuestas correctas) se calcularon como la mediana de los últimos 10 de 15 puntos de giro2. Los umbrales de detección mecánica se determinaron utilizando un conjunto estandarizado de 23 filamentos vFh (Optihair3-Set) con fuerzas entre 0,25 y 265 mN. Los VFhs se aplicaron en orden ascendente en la cara dorsal de la mano (inervación radial) durante 1 s hasta que el participante percibió una sensación táctil. A continuación, se invirtió el orden hasta el momento en que el participante no percibió una sensación táctil. Se tomó como umbral la fuerza media de cinco inversiones. Los umbrales de dolor mecánico se probaron con un conjunto de siete estimuladores de pinchazos ponderados (MRC Systems) con puntas de 0,25 mm y fuerzas entre 8 y 512 mN. Se realizó un método de escalera simple (regla de uno arriba y uno abajo) en el que se preguntaba a los pacientes si el estímulo se percibía como agudo y provocaba la sensación de dolor por pinchazo. Los estímulos se aplicaron en la cara dorsal de la mano después de las tareas de detección de vFh. El umbral se calculó a partir de la media de cinco inversiones. Los umbrales de percepción térmica de calor y frío, y los umbrales de dolor de calor y frío, se probaron utilizando un analizador termosensorial TSA II (MEDOC). El termodo tenía una superficie de 9 cm2, temperaturas de corte entre 0 y 50 °C, y una tasa de cambio de temperatura de 1 °C s-1. El termodo se colocó en la cara volar de la región media del antebrazo (inervación antebraquial medial). Se realizaron tres ensayos consecutivos para cada prueba térmica en el siguiente orden: detección de frío, detección de calor y umbrales de dolor por frío y dolor por calor. Se pidió a los participantes en el estudio que indicaran en qué momento empezaron a experimentar el enfriamiento, el calentamiento y el dolor por frío y por calor. Los umbrales fueron la temperatura media de los tres ensayos de cada prueba.

Ratones

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Berlín (Landesamt für Gesundheit und Soziales) y se llevaron a cabo de acuerdo con la ley europea de bienestar animal. Se utilizaron ratones Ush2a-/- machos y hembras y compañeros de camada de tipo salvaje (Ush2a+/+) del fondo CBA/CaJ de entre 10 y 30 semanas de edad11. Todos los experimentos anatómicos y electrofisiológicos se llevaron a cabo en un número aproximadamente igual de ratones hembra o macho. Para la tarea de detección de vibraciones sólo se utilizaron ratones hembra. Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz:12 h de oscuridad.

Anatomía de los tejidos de los ratones e inmunohistoquímica

Para la inmunohistoquímica de la piel, los ratones fueron eutanasiados por inhalación de CO2 durante 2-4 minutos seguido de una dislocación cervical, y se diseccionó el tejido de la piel de la pata y se eliminaron la hipodermis, los ligamentos y el tejido muscular adjunto. Las muestras de piel se estiraron con alfileres para insectos y se fijaron durante 45 minutos en paraformaldehído al 4% (PFA). Para las secciones de gelatina con vibratomo, las muestras de tejido se colocaron en moldes de incrustación (Polysciences, T-8), se rellenaron con gelatina caliente (20%, disuelta en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M) y se posfijaron en PFA al 4% durante una noche a 4 °C antes de cortar secciones de 120 µm con un vibratomo (Leica, VT100S). Para la tinción de montaje completo, las muestras de piel se estiraron durante 2 horas en PFA y luego se posfijaron a 4 °C durante 24 horas en dimetilsulfóxido al 20% y metanol al 80%. Tras el corte o la postfijación, las muestras de tejido se lavaron tres veces en PBS (0,1 M) y se incubaron durante 72 h a 4 °C en solución de bloqueo y anticuerpos primarios. A continuación, las muestras se lavaron tres veces en PBS antes de incubarlas durante 24 horas (a 4 °C) con anticuerpos secundarios diluidos en solución de bloqueo. A continuación, el tejido se lavó de nuevo tres veces y se procesó para aclarar el tejido utilizando 2,2′-tiodietanol (TDE, Sigma-Aldrich). Las secciones se colocaron en concentraciones crecientes de TDE cada 2 h, del 10% al 25%, 50% y 97%, en las que las muestras se almacenaron y se montaron en portaobjetos y cubreobjetos.

Los anticuerpos policlonales dirigidos a Ush2A fueron generados en el conejo por Eurogentec. Se crearon cuatro anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de unión en los extremos N y C de Ush2A (extremo N: anticuerpo 1, CSPLYNDKPFRSGDNV y anticuerpo 2, C+SWEKPAENFTRGEII; extremo C: anticuerpo 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR y anticuerpo 2, CIRERPPLVPLQKRMT), y se purificaron los antisueros antes de su uso. Los cuatro anticuerpos se utilizaron juntos (1:200) para los protocolos de tinción en las tinciones secuenciales con anti-NF200 de pollo (Millipore, 1:1.000), anti-S100 de conejo (Dako, 1:1.000) o anti-CK20 de cobaya (Origene Tech, 1:200). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anti-conejo Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), anti-pollo Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800), anti-ratón Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), anti-conejo Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800) y anti-conejo Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Se obtuvieron imágenes z-stack en mosaico utilizando un microscopio confocal (Carl-Zeiss, número de catálogo LSM700) con el software Zen2009. Los corpúsculos de Meissner inervados por fibras nerviosas NF200+ y S100+ y los folículos pilosos se visualizaron y contaron utilizando Fiji/ImageJ. Para obtener imágenes de microscopía electrónica del nervio ciático, se perfundió a los animales y se diseccionó el nervio ciático y se fijó en PFA al 4% y glutaraldehído al 2,5%, y se contrastó con tetróxido de osmio antes de incrustarlo en resina Technovit 7100 (Heraeus Kulzer). Las secciones ultrafinas se capturaron con 5.600 aumentos. Se contaron y midieron las fibras nerviosas mielinizadas y las no mielinizadas utilizando el software Fiji/ImageJ.

Reproducibilidad

Todos los experimentos inmunohistoquímicos y las imágenes capturadas se repitieron en múltiples cohortes de ratones en días diferentes, y no se tomaron imágenes de individuos únicos que no pudieran reproducirse. Las imágenes de microscopía electrónica se tomaron de diferentes compañeros de camada en una única ejecución experimental.

Preparación de nervios de la piel de ratones y registros aferentes sensoriales

Los registros de fibras sensoriales cutáneas se realizaron utilizando la preparación de nervios de la piel ex vivo. Los ratones fueron eutanasiados mediante la inhalación de CO2 durante 2-4 minutos, seguida de la dislocación cervical. Se realizaron tres preparaciones diferentes en experimentos separados utilizando diferentes regiones de la pata: el nervio safeno que inerva la piel peluda de la pata trasera21; el nervio tibial que inerva la piel glabra de la pata trasera; y los nervios medial y cubital que inervan la piel glabra de la pata delantera20. En todas las preparaciones, se afeitó la piel peluda de la extremidad y se diseccionó la piel y el nervio para transferirlos a la cámara de registro, donde se eliminaron los tejidos musculares, óseos y tendinosos de la piel para mejorar la calidad del registro. La cámara de registro se perfundió con un líquido intersticial sintético a 32 °C: 123 mM de NaCl, 3,5 mM de KCl, 0,7 mM de MgSO4, 1,7 mM de NaH2PO4, 2,0 mM de CaCl2, 9,5 mM de gluconato sódico, 5,5 mM de glucosa, 7,5 mM de sacarosa y 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (Hepes), pH 7,4. La piel se fijó con alfileres y se estiró, de modo que la parte exterior de la piel pudiera estimularse mediante sondas de estimulación. El nervio periférico se introdujo en una cámara adyacente en aceite mineral, donde se extrajeron finos filamentos del nervio y se colocaron en un electrodo de registro de alambre de plata.

Los campos receptivos de los mecanorreceptores individuales se identificaron sondeando mecánicamente la superficie de la piel con una varilla de vidrio roma o unas pinzas romas. La salida analógica de un amplificador Neurolog fue filtrada y digitalizada utilizando el sistema Powerlab 4/30 y el software Labchart 7.1 (ADinstruments). Se utilizó la extensión de histograma de picos para Labchart 7.1 para clasificar los picos de las unidades individuales. Se administraron estímulos eléctricos (1 Hz, pulsos cuadrados de 50-500 ms) a campos receptivos de unidades individuales para medir la velocidad de conducción y permitir la clasificación como fibras C (velocidad <1,2 m s-1), fibras Aδ (1,2-10 m s-1) o fibras Aβ (>10 m s-1). La estimulación mecánica de los campos receptivos de las neuronas se realizó utilizando un actuador piezoeléctrico (Physik Instrumente, nº de catálogo P-841.60) y un nanomotor de doble punta (Kleindiek Nanotechnik, nº de catálogo MM-NM3108) conectado a un dispositivo de medición de fuerza (Kleindiek Nanotechnik, nº de catálogo PL-FMS-LS). Las mediciones de fuerza calibradas se adquirieron simultáneamente utilizando el sistema Powerlab y el software Labchart durante el experimento (Datos extendidos Fig. 10).

Como los diferentes tipos de fibras tienen diferentes propiedades de sintonización de estímulos, se utilizaron diferentes protocolos de estímulos mecánicos basados en el tipo de unidad. Las fibras Aβ de bajo umbral (RAMs y SAMs) y los pelos D de las fibras Aδ se estimularon con el actuador piezoeléctrico con tres estímulos de vibración (5 Hz, 25 Hz y 50 Hz, las distorsiones introducidas por el sensor de fuerza en serie excluyeron el uso de frecuencias >50 Hz) con una amplitud creciente en seis pasos (amplitudes de pico a pico de ~6-65 mN; 20 ciclos por paso), y una secuencia de estímulo dinámico con cuatro formas de onda de rampa y retención con velocidades de deflexión de la sonda variables (3 s de duración; 0.075, 0,15, 0,45 y 1,5 mm s-1; amplitud media de 100 mN). Las SAM y RAM de las fibras Aβ se clasificaron por la presencia o ausencia de disparos durante la fase estática de un estímulo de rampa y retención, respectivamente, como se ha descrito previamente20,21. Las unidades individuales se estimularon adicionalmente con una serie de cinco estímulos mecánicos estáticos con formas de onda de rampa y retención de amplitud creciente (3 s de duración; desde ~10 mN hasta 260 mN). Los SAM de bajo umbral, las fibras Aδ de alto umbral y las fibras C también se estimularon utilizando el nanomotor con cinco estímulos de rampa y retención con amplitudes crecientes20.

Registros de una sola unidad de los aferentes pacinianos

Para evaluar la mecanosensibilidad de los corpúsculos pacinianos situados alrededor del peroné, se retiraron la piel y todos los músculos de la parte inferior de la pierna y se diseccionó el nervio interóseo libre de la membrana interósea. Posteriormente, el peroné y la tibia, que en los ratones están fusionados a lo largo de su mitad distal, se retiraron del animal, junto con el nervio interóseo, y se transfirieron a una cámara de baño de órganos personalizada, donde se montaron utilizando un minivice personalizado. Todo el procedimiento de disección se realizó en un tampón de disección frío que contenía 108 mM de N-metil-d-glucamina, 20 mM de Hepes, 3,5 mM de KCl, 10 mM de MgSO4, 26 mM de NaHCO3, 1,7 mM de NaH2PO4, 9,5 mM de gluconato sódico, 5,5 mM de glucosa, 18,5 mM de sacarosa y 0,5 mM de CaCl2 (ajustado a pH 7,4 con NaOH). Tras un periodo de recuperación de 10 minutos, la preparación se perfundió con tampón de registro oxigenado (35 °C), que consistía en 108 mM de NaCl, 3,5 mM de KCl, 0.7 mM de MgSO4, 26 mM de NaHCO3, 1,7 mM de NaH2PO4, 9,5 mM de gluconato de sodio, 5,5 mM de glucosa, 7,5 mM de sacarosa y 1,5 mM de CaCl2 (ajustado a pH 7,4 con NaOH), y el extremo proximal del nervio interóseo se transfirió a una cámara de registro llena de aceite introduciéndolo a través de un pequeño orificio (~1 mm de diámetro) que conectaba la cámara de baño del órgano con la cámara de registro adyacente. Tras retirar el perineuro, se diseccionaron los filamentos individuales y se fijaron al electrodo de registro para el registro del potencial de acción. Los registros se realizaron con el sistema Neurolog (Digitimer Ltd, números de catálogo NL100AK y NL104A) y un PowerLab 4SP controlado por LabChart 7.1 (AD Instruments). Para determinar el umbral de activación mecánica y la sintonización de frecuencias de los aferentes pacinianos, se aplicó una serie de estímulos mecánicos sinusoidales (duración 1 s; amplitud linealmente creciente damp/dt = 30 µm s-1; amplitud máxima 30 µm) con frecuencias crecientes (40-480 Hz) en el extremo distal del peroné con una varilla metálica (diámetro de la punta 1 mm) que estaba unida a un actuador piezoeléctrico (Physik Instrumente GmbH, nº de catálogo. P-840.2).

Tarea de aprendizaje de percepción de vibraciones en ratones

Primero, para la implantación del soporte de la cabeza, se anestesió a los ratones con isoflurano (1,5-2% en O2) y se les inyectó por vía subcutánea metamizol (200 mg por kg de peso corporal). Se implantó un soporte metálico ligero en el cráneo con pegamento (UHU dent) y cemento dental (Paladur). La temperatura de los ratones se controló con una sonda rectal y se mantuvo a 37 °C mediante una almohadilla térmica. A continuación, se colocaron los ratones en su jaula de origen con metamizol (200 mg ml-1) en el agua de bebida. Los ratones implantados se habituaron a la sujeción de la cabeza 3-5 días después de la cirugía. Los ratones se habituaron gradualmente a la fijación de la cabeza en el montaje conductual. A continuación, 1 día después del inicio de la restricción de agua, los ratones se sometieron a dos sesiones de emparejamiento en días consecutivos.

Durante las sesiones de emparejamiento (de 30 a 45 minutos de duración), se dieron recompensas de agua desde una boquilla de agua emparejadas con la presentación del estímulo de vibración (3 s de duración, 5 Hz, 60 mN) en la piel glabra de la pata delantera para construir una asociación entre el estímulo y la recompensa. El estímulo de vibración se aplicó a la pata a través de una varilla de vidrio acolchada de 2 mm2, hecha a medida, unida a un actuador piezoeléctrico (PICMA de Physik Instrumente, número de catálogo PL127.11). Se calibró una relación tensión-fuerza utilizando un sistema de medición de fuerza (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) para medir el perfil de fuerza sinusoidal aplicado por el dispositivo piezoeléctrico después de cada experimento. El actuador piezoeléctrico de flexión utilizado podría haber añadido algo de ruido armónico en comparación con otros sistemas piezoeléctricos apilados. Sin embargo, la calibración del piezo en cada experimento garantizó que los déficits sustanciales en la percepción táctil de los ratones deficientes en Ush2a no fueran probablemente un artefacto técnico.

Después del emparejamiento, se iniciaron sesiones diarias de entrenamiento durante las cuales los ratones recibían una pequeña recompensa de agua (4-7 μl) del pico cuando lamían correctamente durante una ventana de oportunidad al inicio del estímulo (3,5 s). Los ensayos de captura, en los que no se presentaba ningún estímulo y los lametones se contaban como falsas alarmas, se intercalaban como el 50% de los ensayos totales. Los ensayos no estaban condicionados por ningún evento o estímulo externo, como se ha descrito previamente10 , y se realizaban en intervalos de tiempo aleatorios entre 3 y 30 s. Si los ratones lamían durante una ventana de 2 s antes del inicio del estímulo, se imponía un retraso de 3 a 30 s para promover la asociación estímulo-agua. Una sesión de entrenamiento constaba de unos 60 ensayos (30× estímulo + 30× captura). Se compararon las tasas de aciertos y falsas alarmas para evaluar el rendimiento durante las sesiones de entrenamiento. Para comprobar que los ratones se lamían en respuesta al estímulo de vibración de la pata delantera, se incluyó una sesión al final del entrenamiento en la que el dispositivo de estimulación se movió 3-5 mm por debajo de la pata, por lo que no se produjo ningún contacto con la piel. En los días experimentales siguientes, después de que los ratones hubieran aprendido con éxito la tarea, se administraron estímulos de vibración con diferentes amplitudes y frecuencias. Para la vibración de 5 Hz, se utilizaron fuerzas de 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN y 6 mN para estimular la pata delantera, con dos amplitudes diferentes intercaladas con ensayos de captura durante cada día. Por ejemplo, los estímulos de 48 mN y 24 mN y los ensayos de captura se intercalaron durante una sesión, que consistió en unos 100 ensayos (33× estímulo de 48 mN + 33× estímulo de 24 mN + 34× captura). Los estímulos de 6 mN se probaron en dos sesiones. Para las vibraciones de 25-Hz y 125-Hz, las fuerzas de 60-mN y 12-mN de la misma frecuencia se intercalaron con los ensayos de captura de la misma manera durante dos sesiones de prueba.

Ensayo conductual de inhibición de pulsos emparejados en ratones

La respuesta de sobresalto de los ratones se evaluó utilizando el sistema de respuesta de sobresalto (SR-LAB, San Diego Instruments). Los ratones se habituaron al aparato durante 30 minutos cada día durante 3 días antes de la prueba. En resumen, se midieron las respuestas de sobresalto de los ratones en un total de 48 ensayos de pulso solo45 (40 ms de duración, 129 dB) y ensayos de prepulso + pulso (20 ms de prepulso de 69, 73 o 81 dB). Los ensayos de prepulso se realizaron 200 ms antes de los ensayos de pulso. El porcentaje de inhibición de pulso emparejado (% PPI) para cada intensidad de prepulso se calculó como %PPI = 100 × ((solo pulso) – (prepulso + pulso))/solo pulso.

Ensayos conductuales de vFh y cepillo en ratones

Los ratones se habituaron al entorno de la prueba durante 30 minutos cada día durante 3 días antes de la prueba. En los días experimentales, los ratones se colocaron en cubículos individuales de plexiglás sobre una plataforma de malla elevada. Para el ensayo del cepillado, se acarició la pata trasera izquierda desde el talón hasta los pies con un cepillo de pintura de 2 mm de cabeza 10× a intervalos aleatorios. Se calculó el porcentaje de retiradas. En los días siguientes de la prueba, se midieron los umbrales de retirada nociva mecánica utilizando vFhs. Brevemente, se estimularon las superficies plantares de la pata trasera izquierda con filamentos de vFh y se determinó el umbral de reflejo utilizando el método arriba-abajo46. Dependiendo de la respuesta del animal, se aplicaron vFhs de mayor o menor fuerza a la pata trasera para establecer una serie de seis a nueve retiradas reflejas positivas o negativas. Este patrón de respuestas se convirtió de forma que los datos se expresaran como el logaritmo de la media del umbral de retirada del reflejo del 50%46.

Análisis de datos de psicofísica humana

Se comprobó la normalidad de los datos y se compararon las diferencias en el rendimiento psicofísico de cada prueba entre los participantes de control y los pacientes con síndrome de Usher mediante pruebas t de Student no apareadas o pruebas U de Mann-Whitney. Las transformaciones z se utilizaron para comparar los perfiles de datos individuales con la media y la densidad relativa de los controles sanos. La puntuación z se calculó utilizando hojas de cálculo Excel basadas en la fórmula z = (puntuación del paciente – media del grupo por s.d. de la media del grupo). Los valores z >0 indican ganancia de función, lo que significa que el participante es más sensible a los estímulos probados en comparación con los controles sanos. Se pueden identificar las puntuaciones z individuales que se encuentran fuera del intervalo de confianza del 95% (es decir, puntuación z <1,96 o >1,96 s.d.) del conjunto de datos de los controles sanos. El rendimiento en cada prueba se comprobó en comparaciones por pares utilizando la prueba U de Mann-Whitney y consideramos que P < 0,01 era estadísticamente significativo.

Análisis de datos del comportamiento de vibración de los ratones

Los golpes se registraron con un sensor en la punta del pico de recompensa de agua. En los ensayos de estímulo, se contaba un acierto cuando había un lametón dentro de la ventana de oportunidad (3,5 s) tras el inicio del estímulo. Los datos de comportamiento se recogieron utilizando rutinas personalizadas en Lab View a una tasa de muestreo de 1 kHz, y se utilizaron scripts personalizados de Python para el análisis. Durante los ensayos de captura, se producía una falsa alarma cuando había un lametón durante una ventana de oportunidad igualmente larga. Para evaluar si los ratones aprendieron con éxito la tarea de detección, se compararon las tasas de aciertos con las tasas de falsas alarmas dentro de la misma sesión de entrenamiento, utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de dos medidas repetidas con la prueba post-hoc de Bonferroni.

Para cuantificar el rendimiento en las tareas de detección, utilizamos d’ (índice de sensibilidad) en lugar del porcentaje de ensayos correctos para tener en cuenta el sesgo en los criterios de lamido47. Para calcular d’, se utilizó la siguiente fórmula: d’ = z(h) – z(fa), donde z(h) y z(fa) son la inversa normal de la función de distribución acumulativa de las tasas de aciertos y falsas alarmas, respectivamente. Para evitar que los valores de d’ sean infinitos, cuando todos los ensayos fueron reportados (tasa = 1) o ninguno lo fue (tasa = 0), las tasas fueron reemplazadas por (1½N) o (½ N), respectivamente, donde N es el número de ensayos en los que se presentó el estímulo48. Las puntuaciones z para las tasas de aciertos y falsas alarmas se calcularon utilizando OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) con la función NORMINV. Hemos realizado pruebas estadísticas sobre los datos sólo cuando al menos uno de los genotipos muestra d’ > 1,0, lo que indica que estos ratones informaron del estímulo. Los datos de comportamiento se recogieron utilizando rutinas personalizadas en Lab View a una tasa de muestreo de 1 kHz, y se utilizaron scripts personalizados de Python para el análisis. Los códigos y secuencias de comandos personalizados están disponibles bajo petición; más información está disponible en el Resumen de Informes de Investigación de la Naturaleza asociado a este manuscrito.

Los comportamientos de lamido se calcularon y trazaron como probabilidad de lamido, frecuencia de primer lamido (Hz) o latencia media de primer lamido (s). Estas medidas se calcularon de la siguiente manera: la probabilidad de lamer es la probabilidad de que un ratón lama al menos una vez durante la ventana de oportunidad en un ensayo de estímulo o de captura (ensayos con al menos 1 lametazo/total de ensayos). En los PSTH de los primeros lametones mostramos la distribución de las latencias de los primeros lametones en los ensayos de estímulo o captura. Para normalizar estos datos entre los ratones, dividimos el número de primeros lametones por el número total de ensayos. Dividiendo el valor de los primeros lametazos por el ancho de la bandeja, calculamos el valor en hertzios (lametazos por s). La latencia media del primer lametazo (s) se calculó sumando las latencias del primer lametazo en cada ensayo de acierto y dividiendo por el número total de ensayos.

Análisis de datos de las grabaciones de la preparación de los nervios de la piel

Las unidades cutáneas de la pata delantera y la pata trasera se clasificaron en función de su velocidad de conducción y sus respuestas a los estímulos mecánicos. Los umbrales mecánicos de las unidades se calcularon como la temperatura o la amplitud mecánica necesaria para provocar el primer potencial de acción. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 6.0 y Python. Las pruebas estadísticas incluyen ANOVAs de medidas repetidas de dos vías con la prueba post-hoc de Bonferroni, pruebas t de Student, pruebas U de Mann-Whitney y pruebas de pares emparejados de Wilcoxon. Se utilizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov para evaluar la normalidad de los datos. Los asteriscos en las figuras indican significación estadística: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Análisis de datos de microscopía electrónica de nervios de ratón

Para el análisis de las micrografías electrónicas del nervio ciático de ratón, se contó el número de fibras mielinizadas y no mielinizadas en 12 secciones por nervio. A continuación, se extrapoló el número total de fibras por nervio a partir del área de la sección transversal de cada nervio.

Resumen del informe

Se puede obtener más información sobre el diseño de la investigación en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.