La leishmaniosis canina (CanL) es una infección/enfermedad protozoaria causada por Leishmania infantum (sinónimos: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi) altamente prevalente en todos los países de las regiones mediterránea, caucásica y de Oriente Medio del Viejo Mundo, así como en varios territorios de América Latina (Dantas-Torres et al., 2012). Los resultados de la infección en los perros van desde lo subclínico hasta lo clínico, y desde la enfermedad leve hasta la grave. Aunque el parásito puede transmitirse ocasionalmente por vías no vectoriales (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), la principal vía de transmisión es la picadura de flebótomos infectados. A partir de unos 7 días después de una comida de sangre infectada, los vectores competentes pueden desarrollar promastigotes infecciosos de Leishmania en el intestino anterior, que son regurgitados en la piel del mamífero huésped durante la siguiente comida de sangre (Bates, 2007). Tanto los perros subclínicos como los enfermos pueden ser infecciosos para los vectores; sin embargo, la probabilidad de contribuir desproporcionadamente a la transmisión ulterior (efecto «superdifusor») aumenta con la duración y la gravedad del CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus es el principal vector competente de L. infantum en toda la cuenca mediterránea occidental, incluyendo el sur de Europa y el noroeste de África (Centro Europeo para la Prevención y el Control de las Enfermedades, 2019). Además, P. perniciosus es un miembro representativo de un grupo taxonómico más amplio, el subgénero Larroussius, formado por especies afines desde el punto de vista morfológico, genético y biológico que actúan como vectores competentes de L. infantum en el Mediterráneo central y oriental, como Phlebotomus neglectus y Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). El uso de piretroides tópicos se considera universalmente el enfoque de primera línea para proteger a los perros sanos de las picaduras de los flebótomos infectados por Leishmania (Maroli et al., 2010), mientras que el manejo de los perros infectados/infecciosos es una tarea compleja debido a la falta de un amplio consenso con respecto al enfoque a tomar. Idealmente, la atención veterinaria individual para el manejo de la patología del CanL debería combinarse con medidas destinadas a evitar la propagación del parásito a través del vector. Esto último es especialmente importante como parte de los programas de control de la LV zoonótica que se llevan a cabo actualmente en varios países endémicos. Por un lado, los propietarios son reacios a invertir en productos piretroides para los perros ya infectados o enfermos; por otro lado, las terapias antileishmania solo tienen una eficacia temporal para reducir de forma consistente la infectividad de un perro a los flebótomos (Miró et al., 2017). Las isoxazolinas son una nueva clase de compuestos dirigidos al sistema nervioso central y a las uniones neuromusculares de los artrópodos vectores mediante el bloqueo de los canales de cloruro activados por ligando, lo que provoca la muerte del artrópodo (Weber & Selzer, 2016). Varios compuestos han sido autorizados como medicamentos veterinarios para la protección de los animales de compañía contra pulgas y garrapatas, con largas vidas medias in vivo que proporcionan semanas a meses de protección después de una sola administración oral (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Estas propiedades atrajeron la atención para el uso potencial de las isoxazolinas para el control de enfermedades humanas transmitidas por vectores (Miglianico et al., 2018). En cuanto a los insectos voladores, se encontró que tanto el grado como la duración de la eficacia insecticida difieren entre los fármacos isoxazolínicos disponibles en el mercado cuando se administran en perros, como por ejemplo contra Triatoma infestans (Loza et al., 2017) o la mosca de la arena Phlebotomus papatasi (Gómez et al., 2018a), mostrando que fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) es el compuesto más activo con respecto a los parámetros de eficacia mencionados. Recientemente, un ensayo clínico de tratamiento con fluralaner en perros contra los flebótomos hizo uso de P. papatasi colonizado como especie objetivo (Gómez et al., 2018b). Sin embargo, esta especie puede no considerarse un modelo adecuado de mosca de la arena. Esto se debe principalmente a que P. papatasi no es un vector competente de L. infantum, siendo refractario al desarrollo intestinal de este parásito. Además, estudios anteriores sobre piretroides tópicos caninos (Maroli et al., 2010) sugieren que P. papatasi podría ser menos susceptible a los compuestos dirigidos al sistema nervioso central de la mosca de la arena que P. perniciosus. Por ejemplo, una formulación spot-on del 50% de permetrina-10% de imidacloprid mató al 29% de P. papatasi frente al 49% de P. perniciosus. Estas consideraciones nos llevaron a determinar el inicio y la duración de la eficacia insecticida contra P. perniciosus después de alimentarse de perros tratados con fluralaner.

Se realizó un estudio de eficacia diseñado en grupos paralelos, controlado negativamente, aleatorizado, ciego y en un solo centro. Los perros experimentales, consistentes en Beagles machos de ≥ 6 meses de edad en el momento de la inclusión, procedían de una colonia de investigación en Mohammedia, Marruecos; el estudio en fase de vida se realizó en las instalaciones de Clinvet. Los ejemplares adultos de P. perniciosus procedían de una cepa española mantenida desde junio de 2012 en las instalaciones de entomología médica del Istituto Superiore di Sanità, Italia, a 28 ± 1 °C y 75-80% de humedad relativa. Se certificó que los flebótomos estaban libres de patógenos y se adaptaron a las condiciones de cría en masa con seis sublíneas de colonias independientes. Los ejemplares de tres a nueve días de edad se agruparon a partir de las respectivas jaulas emergentes y se distribuyeron en proporciones de edad similares en botes cilíndricos de plástico (400 mL) provistos de una tapa hermética, que se perforó y cubrió el orificio con una gasa fina que contenía un trozo de algodón empapado con solución saturada de glucosa. El número de flebótomos en cada maceta era suficiente para un perro, con la adición de algunos ejemplares extra para compensar las muertes que se produjeron antes de los experimentos. Las macetas se introdujeron en bolsas de plástico herméticas provistas de papel de filtro humedecido. El embalaje secundario consistió en un contenedor precalentado provisto de un dispositivo de estabilidad de temperatura ampliada y un registrador digital de temperatura, rodeado de una caja de cartón resistente. Las cajas se enviaron a Marruecos por vía aérea y la entrega se produjo aproximadamente a los 3 días del envío. En el momento de la entrega, se comprobó el registro de la temperatura y las bolsas de plástico se dejaron sin abrir a 25 ± 3 °C en espera de la exposición de los perros. Se realizó una evaluación aproximada de la mortalidad de la mosca de la arena en las macetas desde el exterior, y se consideró aceptable una tasa de mortalidad de ≤ 10% por maceta. En última instancia, en el momento de los experimentos, cada perro fue expuesto a la misma población homogénea de moscas de la arena de 7 a 14 días.

Veintisiete días antes del tratamiento, 14 perros Beagle macho fueron sedados con Domitor® (Vetoquinol, Lure, Francia) y su cabeza fue expuesta durante 1 h a las mordeduras de aproximadamente 40 hembras de P. perniciosus enjauladas, junto con cinco machos para promover el comportamiento de mordedura, con el objetivo de evaluar la atracción individual hacia el vector en estas condiciones experimentales. Los perros se clasificaron en orden descendente según los recuentos de ejemplares vivos alimentados con sangre; se excluyeron del estudio los dos perros que tenían los recuentos más bajos, y se incluyeron doce perros que se asignaron a dos grupos de seis perros cada uno (Grupos 1 y 2). El día 0, los perros del Grupo 2 fueron tratados con una dosis oral de fluralaner (comprimidos masticables Bravecto®) a una tasa de dosis de la etiqueta de 25 a 56 mg/kg de peso corporal, mientras que los perros del Grupo 1 permanecieron sin tratar. Se realizaron observaciones sanitarias específicas a las 1, 2 y 6 h de la administración de fluralaner al último perro. La exposición de los perros a unas 40-60 hembras de P. perniciosus (más 5-10 machos) se llevó a cabo en paralelo para ambos grupos, en condiciones similares de temperatura y humedad en dos salas, los días 1, 28 y 84 (inicialmente se consideró una evaluación intermedia para el periodo de unos 50-60 días después del tratamiento, aunque no fue posible por cuestiones técnicas y logísticas). El criterio principal para la determinación de la eficacia fue la tasa de supervivencia de los flebótomos alimentados totalmente con perros tratados frente a los alimentados totalmente con perros de control, no considerándose los ejemplares alimentados parcial o marginalmente con sangre. Para permitir comparaciones óptimas y duraderas entre los dos grupos de especímenes de mosca de la arena, las hembras se recogieron individualmente de las jaulas de exposición mediante una suave aspiración bucal, y se agruparon en grupos de ≤ 10 especímenes dentro de macetas de plástico forradas de yeso. A continuación, las macetas se colocaron en cajas provistas de glucosa saturada y papel de filtro humedecido, y se mantuvieron a partir de entonces a 26 °C. Las evaluaciones de viabilidad se realizaron a las 6 h (excepto el día 1), y luego a intervalos de 24 h hasta un máximo de 96 h después del final de la exposición. Para evaluar la viabilidad general del lote de moscas de la arena empleado en cada experimento, los procedimientos descritos anteriormente se aplicaron tanto a las hembras alimentadas como a las no alimentadas.

La significación estadística de los resultados de la eficacia insecticida, expresada como la proporción de moscas de la arena alimentadas vivas del Grupo 2 frente a las del Grupo 1, se calculó utilizando un modelo lineal mixto que incluía el grupo de estudio como efecto fijo y un bloque de aleatorización como efecto aleatorio, con el nivel de significación fijado en α = 0,05 (de dos caras). El modelo utilizó el ajuste de Kenward-Rogers para determinar los grados de libertad del denominador.

En el día 1, se evaluaron 78 especímenes alimentados con sangre de un total de 159 hembras vivas recogidas de los perros del Grupo 2 frente a 64 especímenes alimentados con sangre/169 hembras vivas de los perros del Grupo 1. El día 28, los especímenes alimentados con sangre fueron 199/341 hembras vivas del Grupo 2, que se evaluaron frente a 146/310 del Grupo 1. El día 84, los especímenes alimentados con sangre fueron 240/326 del Grupo 2 y 206/339 del Grupo 1, respectivamente. La tabla 1 muestra las proporciones medias de P. perniciosus supervivientes tras tomar una comida de sangre en perros tratados y no tratados. En el día 1 desde el tratamiento, hubo evidencias de algunas muertes entre los flebótomos que ya estaban en el momento de la recogida en las jaulas de exposición del Grupo 2, aunque ninguna en las del Grupo 1. A las 24 h, todos los especímenes alimentados con sangre del Grupo 2 estaban muertos, en contraste con el 11% de los especímenes alimentados con sangre del Grupo 1. En el día 28, la supervivencia de los ejemplares alimentados con perros del Grupo 2 era significativamente menor que la de los del Grupo 1 ya a las 6 h después de la comida de sangre; de nuevo, todos los ejemplares alimentados con sangre del Grupo 2 estaban muertos a las 24 h, en contraste con el 3% de los ejemplares alimentados con sangre del Grupo 1. En el día 84, varios ejemplares que se habían alimentado de perros tratados sobrevivieron hasta el final de las observaciones, con amplias variaciones dentro del grupo; su tasa de supervivencia disminuyó a partir de las 24 h y fue significativamente menor a partir de las 48 h en comparación con los ejemplares alimentados de perros de control, con una actividad insecticida calculada superior al 50% hasta las 96 h de observación.

Tasas de supervivencia de los flebótomos no alimentados recogidos de las jaulas de exposición también se evaluaron hasta 96 h después de la exposición de cada perro. En general fueron elevadas y más altas en comparación con las de los ejemplares alimentados con sangre, mostrando algunas diferencias entre cada día de exposición de un perro, aunque no tanto entre los grupos experimentales en cada exposición. Esto puede reflejar las variaciones de mortalidad entre lotes que suelen producirse entre generaciones de flebótomos colonizados, y posiblemente las diferentes condiciones de transporte. La ingestión de sangre fue la única variable asociada con el 100% de mortalidad de los flebótomos en los perros tratados con fluralaner (Fig. 1).

El presente estudio, aunque no compara las diferentes especies de moscas de la arena, proporciona más pruebas de que la susceptibilidad a los productos insecticidas caninos dirigidos al sistema nervioso central de las moscas de la arena, puede ser mayor en P. perniciosus que en P. papatasi. Utilizando la misma formulación y dosis de fluralaner en un estudio que incluía a Beagles expuestos a esta especie, Gómez et al. (2018b) registraron una supervivencia parcial de las hembras de P. papatasi alimentadas con sangre (del orden del 6-7%) ya a los 17-31 días post-tratamiento, que aumentó hasta aproximadamente el 25% al día 45.

Hay >5 días de retraso para que una mosca de la arena sea infecciosa tras ingerir una comida de sangre infectada. Por lo tanto, existe un reto técnico para los estudios de insecticidas sistémicos en los flebótomos con respecto a mantener una supervivencia alta y duradera de los especímenes de control alimentados con sangre y detectar cualquier efecto insecticida retardado que todavía tenga un potencial de bloqueo de la transmisión. Este reto es diferente de la mayoría de los estudios comunes con tratamientos antialimentación, en los que los operadores matan a las moscas de la arena inmediatamente después de la exposición de un perro y las califican como alimentadas con sangre/no alimentadas. Se necesitan evaluaciones a largo plazo para asegurar la interpretación significativa y la significación estadística de las diferencias de supervivencia entre los grupos tratados y los de control (por ejemplo, durante las concentraciones de fase descendente de los fármacos en el plasma canino). El uso de sangre canina ex vivo de perros tratados y de control en sistemas de alimentación artificial puede ser propenso a la contaminación bacteriana y, por lo tanto, dar lugar a la rápida muerte de cualquier mosca de la arena engordada, lo que permite sólo una estrecha ventana temporal para discriminar entre las drogas activas y no activas (Gómez et al., 2018a). En el presente estudio, la tasa de supervivencia de los especímenes de control alimentados con sangre fue muy satisfactoria, con un rango de 61-81% a las 96 h después de la comida de sangre.

La farmacocinética del fluralaner en el plasma canino tras una única administración oral mostró una tendencia descendente regular hasta alrededor de los 100 días post-tratamiento, cuando se vuelve indetectable (Kilp et al., 2014). Es interesante observar que un rango medio teórico de aproximadamente 40-100 ng de fluralaner/mL de plasma, correspondiente a 84 días post-tratamiento, todavía era capaz de matar > el 50% de P. perniciosus dentro de las 48 h después de una comida de sangre. Por lo tanto, es probable que las concentraciones plasmáticas intermedias, como las esperadas entre 28 y 84 días después del tratamiento, también proporcionen una elevada actividad insecticida contra el vector, por lo que se necesitan nuevos estudios para confirmarlo. Por otra parte, los resultados del presente estudio con respecto a los tres puntos temporales muestran claramente una tendencia coherente de reducción de la eficacia a lo largo del estudio.

En conclusión, el tratamiento con fluralaner de los perros representa un método prometedor para reducir el conjunto de vectores infectados en entornos endémicos de LV zoonótica. Además, el uso de fluralaner en combinación con tratamientos tópicos preventivos con piretroides, siempre que esto no esté contraindicado para la seguridad del perro (Walther et al., 2014), podría proporcionar beneficios para los perros en zonas de alto riesgo.