INFORME DE UN CASO

Un niño de 5 años fue diagnosticado de leucemia linfoblástica aguda en diciembre de 1994 e incluido en el protocolo Fralle 93. El niño alcanzó la remisión hematológica 6 semanas después de iniciarse la quimioterapia de inducción. Fue atendido como paciente externo y respondió bien al tratamiento en los años siguientes. Sin embargo, en una consulta de marzo de 1997, el paciente tuvo un episodio febril al ser perfundido con el sistema Port-a-cath. El examen clínico no mostró ninguna localización séptica. El recuento de leucocitos era de 10.860/ml, con un recuento absoluto de neutrófilos de 8.850/ml. Se recogió una serie de hemocultivos del Port-a-cath, y el cultivo aeróbico en botella arrojó colonias amarillas-pigmentadas de bacilos corineformes gram-positivos. El niño recibió ceftriaxona (1 g) por vía intravenosa una vez, seguida de cefadroxil 500 mg dos veces al día durante 7 días. Debido a la persistencia de la fiebre, se administró cefadroxil durante otra semana y se suspendieron los fármacos inmunosupresores durante el mismo período. La historia del paciente no tuvo ninguna novedad durante los dos meses siguientes, y no se realizó ningún hemocultivo cuando acudió a sus visitas mensuales. En junio de 1997, el niño acudió a la consulta como subfebril y quejándose de fatiga. La exploración física no reveló ningún foco de infección y el recuento de leucocitos no estaba elevado. Se tomó una serie de hemocultivos del Port-a-cath, y el vial aeróbico reveló los mismos bacilos corineformes grampositivos, posteriormente identificados como Microbacterium sp. Se diagnosticó bacteriemia relacionada con el catéter, y se retiró el catéter venoso central. Se administró Ampicilina (100 mg/kg/día) por vía intravenosa perioperatoria, con la primera dosis administrada 24 horas antes de la cirugía. El estado clínico de la paciente mejoró rápidamente después. El Port-a-cath se cultivó en agar sangre Columbia. En 24 horas a 37°C, creció un cultivo puro de colonias amarillas-pigmentadas de un bastón no fermentativo, gram-positivo y algo descolorido. Desgraciadamente, se perdieron los subcultivos y no se pudieron realizar más exámenes.

La cepa aislada de los cultivos de sangre del paciente, etiquetada como CF36, era una corineforme móvil, de color amarillo, con un metabolismo oxidativo, actividad proteolítica y ácidos grasos celulares del tipo ramificado. Estas características generales son sugestivas del género Microbacterium, que incluye tanto especies fermentativas como oxidativas, estas últimas denominadas anteriormente Aureobacterium (13).

La secuencia del gen 16S rRNA (rDNA) se estudió utilizando un conjunto de cebadores para la amplificación. Los productos de la PCR se purificaron de un gel de agarosa con un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Westburg, Países Bajos). El análisis de la secuencia se realizó con un secuenciador automático de ADN 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, California) utilizando el kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction. Cada secuencia se comparó con los datos de secuencias disponibles en las bases de datos utilizando BLAST (10). Se construyó un árbol filogenético mediante el método de unión de vecinos (8, 11).

La secuenciación del ADNr 16S basada en 1.490 nucleótidos de la cepa CF36 reveló los niveles más altos de similitud del 99,5% con la secuencia de M. luteolum DSM 20143T y del 99,3% con la secuencia de M. oxydans DSM 20578T. También estaba estrechamente relacionada con las secuencias de M. saperdae (99,2%) y M. liquefaciens (99,1%) (Tabla1).1). Se recogieron otras cuatro cepas similares de varias muestras de otros pacientes que fueron etiquetadas como CF7 aislada de un cultivo de sangre, CF34 de un aspirado bronquial, CF130 de un cultivo de sangre y CF40 de una fuente humana desconocida. Una cepa adicional, CF128, se obtuvo de una muestra vegetal. Las cinco cepas mostraron secuencias de ADNr 16S similares a las de la cepa tipo de M. oxydans, con una similitud del 99,3 al 99,4%, mientras que sus índices de similitud con CF36 fueron del 99,9 al 100%. Otros nueve aislados clínicos mostraron una similitud del 99,9 al 100% con la cepa tipo de M. oxydans.

Estos resultados nos llevaron a realizar un amplio estudio de las siguientes seis cepas: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 y CF130.

Los ácidos grasos celulares, determinados como se ha descrito anteriormente (14), mostraron el mismo perfil en todas las cepas. Los porcentajes medios de los principales ácidos grasos celulares fueron los siguientes: 40,3% anteiso-C15:0 (rango, 37,1 a 46,0%), 27% anteiso-C17:0 (rango, 22,9 a 31,3%), 15,7% iso-C16:0 (rango, 13,8 a 19,3%), 9,3% iso-C15:0 (rango, 4,6 a 13,9%) y 4,2% iso-C17:0 (rango, 3,0 a 7,2%).

El análisis del peptidoglicano de la pared celular de CF36 y CF7 se llevó a cabo en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Alemania) por N. Weiss con un método de cromatografía de capa fina según lo indicado por Schleifer y Kandler (12). El peptidoglicano era del tipo B2β con d-ornitina como diaminoácido.

La hibridación ADN-ADN fue llevada a cabo por P. Schumann en el DSMZ según lo descrito por De Ley et al. (3) con las modificaciones de Escara y Hutton (4) y Huss et al. (7). El índice de homología de ADN de CF36 con M. luteolum LMG 16207T fue sólo del 33,7%, y el de M. oxydans DSM 20578T fue del 46,6%, pero se obtuvieron altos niveles de parentesco de ADN del 78,1, 81,8 y 78,2% con las cepas CF7, CF34 y CF40, respectivamente. Esto era coherente con su asignación a una única especie. El contenido de G+C del ADN de la cepa CF36 fue de 69,9 mol%, según se determinó en el DSMZ.

Las seis cepas eran varillas corineformes, móviles y grampositivas. Crecieron bien en agar sangre Columbia a 37°C, y el color de las colonias era amarillo. Las cepas eran estrictamente aeróbicas, catalasa positivas y oxidasa negativas. Eran capaces de hidrolizar esculina y gelatina. Aunque la secuenciación del ADNr 16S mostró una estrecha relación con M. luteolum, M. saperdae y M. liquefaciens, estas especies eran fenotípicamente muy diferentes. Ninguna de ellas crecía a 37°C, M. luteolum y M. liquefaciens no eran móviles, y M. luteolum y M. saperdae no eran proteolíticas. Estos resultados coinciden con los datos de la literatura (2). Las propiedades fenotípicas de las cepas fueron muy similares a las de M. oxydans. La glucosa se acidificó de forma oxidativa en agar rojo fenol de baja peptona (15). Todas las cepas crecieron a 40°C, mientras que ninguno de los aislados de M. oxydans fue capaz de crecer a esa temperatura. Además, la salicina no se acidificó, en contraste con M. oxydans. Las nuevas cepas también pudieron diferenciarse de M. oxydans mediante las tiras de asimilación API 50CH (bioMérieux). Se utilizó la lactosa y no el 2-cetogluconato, mientras que M. oxydans tuvo las reacciones opuestas. Cuando se utilizaron las tiras API ZYM (bioMérieux), las reacciones negativas para la esterasa lipasa (C8), la α-quimotripsina y la β-glucosidasa separaron las seis cepas de M. oxydans. Las características fenotípicas que diferencian a las nuevas cepas de las especies de Microbacterium oxidativas, móviles y proteolíticas relacionadas que crecen a 37°C se reportan en la Tabla22.

La susceptibilidad a los antibióticos se probó en agar Mueller-Hinton con tiras E-test (PDM, Solna, Suecia). Los rangos de CIM (microgramos por mililitro) fueron los siguientes: penicilina, de 1,5 a 2; ampicilina, de 1 a 1,5; cefotaxima, de 3 a 6; cefalotina, de 16 a 24; ciprofloxacina, de 1 a 1,5; gentamicina, de 2 a 3; vancomicina, de 3 a 4; claritromicina, <0,016.

Los estudios fenotípicos, quimiotaxonómicos y genéticos sugieren que las seis cepas del estudio pertenecen al género Microbacterium pero constituyen una nueva especie, para la que se propone el nombre de Microbacterium paraoxydans y que está estrechamente relacionada con M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum y M. liquefaciens (Fig. (Fig.11).