Introducción

La presencia de vértebras es una característica definitoria del plan corporal de los vertebrados. Un esqueleto vertebral puede consistir en una serie de arcos neurales emparejados que cubren la médula espinal, arcos hemales emparejados que encierran la arteria y la vena caudal y, en muchos vertebrados con mandíbula (gnatostomas), una serie de centros que sustituyen a la notocorda como estructura de soporte predominante. Los centros vertebrales son muy variables en cuanto a su morfología y composición tisular, y es probable que hayan evolucionado de forma independiente en muchos linajes diferentes de gnatóstomos, incluidos los tetrápodos, los peces teleósteos y los peces cartilaginosos. Esta aparente convergencia evolutiva plantea cuestiones sobre el origen embrionario de los elementos del esqueleto vertebral en los gnatostomas.

En los tetrápodos, todos los componentes del esqueleto vertebral derivan de los somitas: bloques transitorios y bilaterales de mesodermo paraxial segmentado que se forman dorsalmente dentro del tronco embrionario. Los somitas se dividen en subdivisiones dorsales y ventrales que dan lugar al tejido conectivo y la musculatura del tronco («dermomiotoma») y a los tejidos esqueléticos («esclerotoma»), respectivamente. Los experimentos de rastreo del linaje celular utilizando quimeras de codorniz y inyecciones de fluoresceína-dextrano o injertos de embriones donantes transgénicos de GFP en el ajolote han demostrado un origen totalmente somítico del esqueleto vertebral en estos taxones, con células derivadas del somito recuperadas en los arcos en desarrollo y en el cartílago naciente del centro.

Por el contrario, en los peces teleósteos con aletas de raya, el esqueleto vertebral parece tener un origen embrionario dual, con contribuciones tanto del mesodermo paraxial como de la notocorda. Los centros vertebrales de los teleósteos constan de una capa interna (el cordacentrum) y una capa externa, ambas compuestas por hueso que se forma por osificación intramembranosa. El cordacentrum de los teleósteos se forma primero, por la secreción de proteínas de la matriz ósea (por ejemplo, SPARC, colágeno de tipo I) a partir de células «cordoblásticas» que residen en el epitelio de la notocorda. En el pez cebra, los ensayos in vitro han demostrado que las células de la notocorda cultivadas tienen la capacidad de secretar matriz ósea, y los experimentos de ablación han demostrado que en ausencia de la notocorda, los cordacentros no se forman. Los cordacentros de los teleósteos están posteriormente rodeados por una capa de hueso de membrana derivada del mesodermo paraxial que se desarrolla relativamente tarde. Además, los mutantes del pez cebra con defectos en el patrón de los somitas poseen cordacentros de desarrollo normal, pero presentan profundos defectos en el arco neural y hemal, lo que indica el probable origen mesodérmico paraxial de los tejidos del arco .

Para determinar si el doble origen de los centros vertebrales es una característica específica de los teleósteos del esqueleto vertebral, o una característica general de los gnatóstomos que se ha perdido en los tetrápodos, se necesitan datos sobre el origen embrionario de las vértebras de un grupo externo a los peces óseos (es decir, Osteichthyes: el grupo que incluye a los tetrápodos y teleósteos). Los peces cartilaginosos (Chondrichthyes: tiburones, rayas y holocéfalos) ocupan una posición filogenética clave como grupo hermano de los peces óseos y, por tanto, los datos de este linaje pueden utilizarse para ayudar a inferir las condiciones de desarrollo primitivas del último ancestro común de los gnatostomas. Anteriormente hemos demostrado que las vértebras de la raya pequeña (Leucoraja erinacea) constan de una espina neural dorsal, dos conjuntos de cartílagos dorsales que encierran la médula espinal (arcos neurales e intercalares), un único arco hemal y una espina que se extiende ventralmente, y un centro de tres capas (figura 1). Aquí, utilizamos experimentos de mapeo de destino de somitas y notocordio, así como hibridación in situ de ARNm para genes que codifican proteínas de la matriz esquelética, para comprobar el origen embrionario del esqueleto vertebral de la raya. Demostramos que todos los componentes del esqueleto vertebral de la raya derivan del mesodermo paraxial, sin evidencia de contribuciones celulares o de la matriz de la notocorda. Cuando se consideran junto con los datos de los peces óseos, nuestros hallazgos apuntan a un origen general y probablemente primitivo del mesodermo paraxial de la columna vertebral en los vertebrados con mandíbula.

Material y métodos

(a) Mapeo del destino de los somitos

Los embriones de Leucoraja erinacea se obtuvieron del Laboratorio Biológico Marino (MBL) en Woods Hole, MA, y se mantuvieron en una mesa de mar de flujo a aproximadamente 16°C hasta S24. Se cortó un colgajo en la caja del huevo con una cuchilla de afeitar, y el embrión y la yema se transfirieron a una placa de Petri. Los embriones se anestesiaron en una solución de MS-222 (100 mg l-1 de metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo-Sigma-Aldrich) en agua de mar. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 en etanol) se diluyó 1 : 10 en sacarosa 0,3 M y se inyectó en las porciones ventrales de los somitas (de una a tres inyecciones por embrión) utilizando una aguja capilar de vidrio estirada y un inyector a presión Picospritzer (figura 2a). Los embriones se volvieron a colocar en sus cajas de huevos y se devolvieron a la mesa de mar para que se desarrollaran durante aproximadamente 7 o 12 semanas. A continuación, los embriones se fijaron con PFA al 4%, tal y como se describe en Criswell et al. .

(b) Mapeo del destino de la notocorda

Los embriones se mantuvieron como se ha descrito hasta S14, momento en el que se cortó una pequeña ventana en la caja del huevo sobre el embrión. Se microinyectó CM-DiI en el triángulo de la notocorda como se ha descrito anteriormente (figura 2b). A continuación se selló la ventana con cáscara de huevo de donante y gel Krazy Glue™ (figura 2c), y los huevos se devolvieron a la mesa de mar para que se desarrollaran durante 16-18 semanas adicionales antes de su fijación (como se describe en Criswell et al. ).

(c) Validación de la colocación de la inyección de CM-DiI

Para verificar la correcta colocación de las inyecciones de CM-DiI, se fijaron tres embriones inyectados con somitas inmediatamente después de la inyección, y tres embriones inyectados con notocordio se fijaron 5 días después de la inyección (dpi). Los embriones se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante una noche a 4°C, se enjuagaron 3 × 15 min en PBS y se tiñeron con DAPI a 1 µg ml-1 durante una noche a temperatura ambiente. Los embriones inyectados con somitas fueron fotografiados en un microscopio Zeiss lightsheet y los embriones inyectados con notocordio fueron fotografiados en microscopios confocales Zeiss lightsheet o LSM 780.

(d) Histología e hibridación in situ de ARNm

Los embriones de L. erinacea marcados con CM-DiI fueron incrustados en cera de parafina y seccionados a 8 µm de grosor como se describe en O’Neill et al. para el análisis histológico. Antes de la incrustación, los embriones se desmineralizaron en EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 10% durante 14 días. La tinción histoquímica se realizó siguiendo el protocolo de tricromía de Masson de Witten y Hall. Los experimentos de hibridación in situ para Col1a1 (número de acceso del GenBank MG017616) y SPARC (número de acceso del GenBank MG017615) se realizaron en secciones como se describe en O’Neill et al. , con modificaciones según Gillis et al.

Resultados

(a) Contribución somítica a todos los componentes del esqueleto vertebral de la raya

Para comprobar la contribución somítica al esqueleto vertebral de la raya, microinyectamos CM-DiI en porciones ventrales de los somitas (es decir, el presunto esclerotoma-figura 3a) de embriones de raya en el estadio (S) 24 (Ballard et al. ). El etiquetado focal de los somitas (sin contaminación notocordal) se confirmó mediante microscopía de lámina de luz, en embriones fijados inmediatamente después de la inyección (figura 3b; n = 3). A los 50-52 dpi (S31), las células fusiformes del tejido areolar en desarrollo del centro rodean la notocorda, y el mesénquima preesquelético se ha condensado alrededor del tubo neural y la arteria y vena caudales. En todos los embriones analizados en esta fase (n = 5), se recuperó la CM-DiI en las células fusiformes del tejido areolar en desarrollo (figura 3c), lo que indica su origen somítico.

A los 109 dpi (S34), las vértebras están completamente desarrolladas, con arcos neurales, intercalares y hemales, y un centro tricapa (figura 1). En los embriones analizados en esta fase (n = 4), se recuperaron células positivas para CM-DiI en todo el esqueleto vertebral. Se recuperaron células CM-DiI positivas en el cartílago de los arcos neural (n = 3 vértebras en tres embriones) y hemal (n = 6 vértebras en cuatro embriones; figura 3d,e), así como en la capa interna del cartílago (figura 3f; n = 2 vértebras en dos embriones), el tejido areolar medio (figura 3g; n = 3 vértebras en tres embriones) y el cartílago exterior del centro (figura 3h; n = 3 vértebras en tres embriones). En conjunto, estos hallazgos demuestran la contribución somítica a todos los componentes principales del esqueleto vertebral de la raya.

(b) No hay evidencia de la contribución notocordal al esqueleto vertebral de la raya

Para comprobar las contribuciones celulares de la notocorda al esqueleto vertebral de la raya, realizamos una serie de experimentos de mapeo del destino de la notocorda. En los peces cartilaginosos, la notocorda deriva de una pequeña región triangular de células progenitoras (el «triángulo de la notocorda») que aparece en el margen posterior del blastodisco en S12. Etiquetamos el triángulo de la notocorda de los embriones de raya con CM-DiI en S14 (figura 4a), y confirmamos la localización del colorante en la notocorda a los 5 dpi (aproximadamente en S17) mediante microscopía confocal. En tres embriones examinados en S17, la CM-DiI se encontró sólo en la notocorda (n = 2), o en la notocorda y el tejido neural (n = 1) (figura 4b). En ningún caso se detectaron células marcadas con CM-DiI en el mesodermo paraxial.

Por lo tanto, etiquetamos los triángulos de la notocorda de varios embriones de raya en S14, y criamos estos embriones hasta 116-129 dpi (S34 – momento en el que el esqueleto vertebral se ha diferenciado completamente). Se recuperó la CM-DiI dentro de la notocorda (figura 4c,c′) y el epitelio de la notocorda (figura 4d,d′) de las regiones intervertebrales de la columna axial (n = 5). En tres embriones, se recuperaron células positivas para CM-DiI en los restos de epitelio de la notocorda que persisten en el centro del centrum, donde la notocorda es sustituida casi por completo por la capa interna del cartílago del centrum, pero no se recuperaron condrocitos positivos para CM-DiI en la propia capa interna del cartílago. No se observaron condrocitos marcados con CM-DiI en ningún otro componente de la columna axial. Por lo tanto, estos experimentos no aportan pruebas de una contribución celular de la notocorda al esqueleto vertebral.

En los teleósteos, las células de los cordoblastos dentro del epitelio de la notocorda segregan componentes de la matriz que constituyen el hueso acelular del cordacentral. Aunque las rayas no poseen un cordacentrum, el tejido areolar del centrum de la raya sí se mineraliza, y en su origen se encuentra adyacente al epitelio de la notocorda . Para comprobar si las células epiteliales de la notocorda contribuyen con componentes de la matriz al tejido del centrum en la raya, caracterizamos la expresión de los genes que codifican las proteínas de la matriz ósea Col1a1 y SPARC en el desarrollo del centrum de la raya. No detectamos la transcripción de Col1a1 (figura 5a) o SPARC (figura 5b) en el epitelio de la notocorda. Más bien, estos transcritos se localizaron en las células fusiformes del tejido areolar (figura 5a,b). Estos hallazgos sugieren que las células derivadas del mesodermo paraxial del propio tejido areolar -y no el epitelio de la notocorda- son la fuente de la matriz extracelular del tejido mineralizado del centro vertebral de la raya.

Discusión

Nuestros experimentos de mapeo del destino de los somitos demuestran que el presunto esclerotoma contribuye a todos los componentes de las vértebras en la raya, incluyendo los arcos neural y hemal, y todos los tejidos del centro vertebral de tres capas. Aunque es posible que la DiI se difunda a través de la matriz extracelular después de la inyección y contamine los tejidos adyacentes al objetivo previsto (por ejemplo, la notocorda), hemos controlado esta posibilidad obteniendo imágenes de un subconjunto de embriones poco después de la inyección para validar la precisión de nuestro etiquetado, y realizando experimentos complementarios de mapeo del destino de la notocorda. En estos últimos, encontramos que el etiquetado con CM-DiI de las células progenitoras de la notocorda resultó exclusivamente en el etiquetado de la notocorda y el epitelio de la notocorda, sin contribución a los tejidos vertebrales. En los peces teleósteos, las células de los cordoblastos dentro del epitelio de la notocorda expresan genes que codifican las proteínas de la matriz ósea, el colágeno de tipo I y el SPARC, y son probablemente la fuente de la matriz ósea para la primera capa del centro vertebral. Como las rayas también poseen una capa mineralizada dentro de su centro vertebral, intentamos comprobar la expresión de Col1a1 y SPARC durante el desarrollo vertebral de la raya mediante hibridación in situ de ARNm. Encontramos que estos genes se expresan exclusivamente dentro de las células fusiformes derivadas somáticamente del tejido areolar (el precursor de la capa media mineralizada del centrum-Criswell et al. ), y no en el epitelio de la notocorda. Estos hallazgos sugieren que las células y los componentes de la matriz del centrum vertebral de la raya son enteramente de origen mesodérmico paraxial.

Cuando se considera junto con los datos de los peces óseos, nuestra demostración de un origen somítico del esqueleto vertebral de las rayas sugiere que este tejido fue probablemente la única fuente primitiva de los tejidos del esqueleto vertebral en los gnatostomas, con una contribución de la notocorda al hueso del centrum que representa una condición derivada de los peces teleósteos (figura 6). Las pruebas de los primeros peces fósiles con y sin mandíbula sugieren que el esqueleto vertebral del último ancestro común de los gnatóstomos consistía simplemente en una serie de arcos neurales y una notocorda persistente, sin centro. Varios linajes de gnatostomas, incluidos los peces cartilaginosos elasmobranquios, los teleósteos y los tetrápodos, evolucionaron posteriormente hacia los centros de forma independiente. En sus orígenes, los centros vertebrales de los elasmobranquios y los tetrápodos derivaron completamente del mesodermo paraxial, pero una capa interna de hueso acelular derivado de la notocorda se incorporó al centro con el origen independiente de los centros de los teleósteos.

Sin embargo, aún no está claro si esta condición especializada de los teleósteos es única entre los peces con aletas de raya. A pesar de los recientes cambios en los patrones filogenéticos, es muy probable que las vértebras centrales hayan evolucionado de forma independiente en múltiples linajes de peces con aletas de raya no teleósteos (por ejemplo, en los gars y los bichir). Pero no está claro si la notocorda contribuye con tejido a las diferentes formas de centros observadas en estos taxones. Se necesitan análisis exhaustivos de los orígenes embrionarios de los tejidos vertebrales en taxones de peces estratégicamente seleccionados para resolver mejor el ensamblaje evolutivo y de desarrollo de la diversa gama de esqueletos axiales, posiblemente la característica clave, de los vertebrados en general.

Etica

Todo el trabajo experimental se realizó en cumplimiento de los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales en el MBL.

Accesibilidad a los datos

Los datos de las secuencias asociadas a los genes de este estudio están disponibles en GenBank (número de acceso Col1a1 MG017616 y número de acceso SPARC MG017615).

Contribuciones de los autores

K.E.C. concibió el estudio, realizó la histología, el mapeo del destino y los experimentos de hibridación in situ y redactó el manuscrito; M.I.C. coordinó el estudio y realizó aportaciones al manuscrito; J.A.G. diseñó partes del estudio, coordinó el estudio y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores dieron su aprobación final para la publicación.

Intereses contrapuestos

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Financiación

Este estudio fue apoyado por un DDIG de la National Science Foundation (DEB 1501749), un premio de investigación para estudiantes graduados de la Universidad de Chicago/Laboratorio de Biología Marina, una beca de viaje de la Company of Biologists y una beca de la Royal Society-Shooter International (NF160762) para K.E.C.una beca de investigación universitaria de la Royal Society (UF130182), una beca del Isaac Newton Trust (14.23z) y una beca de investigación de la Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowling y Laura y Arthur Colwin a J.A.G.y una beca de la National Science Foundation (DEB 1541491) y fondos de investigación de la Universidad de Chicago para M.I.C.

Notas de pie de página