Sinónimos

Ácidos grasos no esterificados (NEFA), ácidos grasos libres, ácidos grasos insaturados

Fisiología

Los ácidos grasos no esterificados («libres» o insaturados) (AGNT) son el componente principal de los triglicéridos (las reservas de grasa del cuerpo), que están formados por tres ácidos grasos unidos a una columna vertebral de glicerol. En los animales sanos (cuando están comiendo o no se encuentran en estados de deficiencia energética), los AGNE provienen principalmente de la descomposición de los triglicéridos ingeridos en la dieta a través de los quilomicrones (la lipoproteína lipasa libera los AGNE de los restos de los quilomicrones). Sin embargo, en condiciones de ayuno o en estados de balance energético negativo, la principal fuente de NEFA es la hidrólisis de las reservas de grasa del organismo.

La hidrólisis de los triglicéridos almacenados (grasa) en el tejido adiposo por la lipasa sensible a las hormonas libera NEFAs y glicerol. La lipasa sensible a las hormonas (que se encuentra en el citosol de los adipocitos) es estimulada por varias hormonas, entre ellas el glucagón (que es liberado por las células α de los islotes pancreáticos en respuesta a un nivel bajo de glucosa) y los corticosteroides. Una vez liberados de la grasa o de los quilomirones, los NEFAs pueden ser utilizados como fuente de energía por muchos tejidos, incluyendo el músculo esquelético y los hepatocitos. En los hepatocitos, su destino difiere en función de las necesidades energéticas, el equilibrio hormonal y la disponibilidad de sustrato, es decir, pueden utilizarse para la producción de energía (a través del ciclo de Kreb), volver a empaquetarse en triglicéridos y exportarse como lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) o almacenarse dentro del hígado como triglicéridos (que en exceso pueden causar lipidosis hepática) o convertirse en cetonas.

Metodología

El método principal para medir la concentración de NEFAs en suero es un método enzimático colorimétrico, que es el método utilizado en la Universidad de Cornell.

Tipo de reacción

Reacción de punto final en blanco. La supresión disminuye el efecto de la hemólisis en las concentraciones de NEFA.

Procedimiento utilizado en la Universidad de Cornell

En el primer paso de esta reacción de tres etapas, la acil-CoA sintetasa (ACS) cataliza la acilación de NEFAs a (coenzima A) CoA dando lugar a la formación de acil-CoA. A continuación, se genera peróxido de hidrógeno a partir de la oxidación de acil-CoA mediante la acción catalítica de la acil-CoA oxidasa (ACOD). Por último, el peróxido de hidrógeno en presencia de la peroxidasa (POD) permite la condensación oxidativa de la 4-aminoantipirina con la 3-metil-N-etil-N-(β-hidroxietil)-anilina (MEHA) para formar un producto final azul-púrpura con un máximo de absorbancia a 550 nm. La concentración de NEFA es directamente proporcional a la densidad óptica medida del producto colorante.

Las reacciones se muestran a continuación:

NEFA+ ATP + CoA acil-CoA sintetasa > Acil-CoA + AMP + pirofosfato

Acil-CoA + O2 + acil-CoA oxidasa > 2,3-trans-Enoil-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipirina + MEHA peroxidasa >complejo azul-púrpura+ 3H2O

Unidades de medida

La concentración de NEFAs se mide en mEq/L (unidades convencionales) o mmol/L (unidades SI). La conversión de unidades se obtiene de la siguiente fórmula:

mEq/L x 1= mmol/L

Consideraciones sobre la muestra

Tipo de muestra

Suero o plasma EDTA. El suero/plasma debe separarse de las células lo antes posible después de la recogida y el suero/plasma debe colocarse en un tubo separado. Asimismo, no se recomiendan los tubos corvac (separadores de suero), ya que los valores son ligeramente (pero significativamente) más altos en estos tubos en comparación con los tubos no anticoagulantes (tapa roja).

Anticoagulante

EDTA. Los valores son menos estables en la heparina, que también produce concentraciones basales más altas que el EDTA o el suero y los valores de NEFA aumentan con el almacenamiento (Stokol y Nydam 2005).

Estabilidad

Estable en suero bovino o plasma EDTA a 4°C durante 72 horas. Estable congelado en suero bovino durante 1 mes (-70°C). Los valores aumentan a las 24-48 horas de almacenamiento a 24°C en suero o plasma EDTA. Las concentraciones de NEFA aumentan rápidamente en la heparina después del almacenamiento. (Stokol y Nydam 2005).

Recomendaciones para la toma de muestras en vacas lecheras en transición

• Anticoagulante: Top rojo (suero) o top morado (EDTA). Evitar los tubos de heparina (tapa verde) y corvac (separador de suero).
• Manejo: Separar de las células lo antes posible, mantener en frío para minimizar los falsos cambios en los resultados (los NEFAs son particularmente inestables), enviar lo antes posible al laboratorio.
• Momento de la recogida: Tomar muestras de las vacas a medida que entran en los establos de alimentación (ver más abajo).
  • Preparación de los NEFAs: Recoger muestras de las vacas de 2 a 14 días antes del parto.
  • Postparto NEFAs: Recoger muestras de vacas de 3 a 14 días en leche. La medición de los NEFAs posparto y de la BHB se realiza en un perfil energético de vaca de transición para evaluar el estado energético de las vacas lactantes en el Laboratorio de Patología Clínica de la Universidad de Cornell.
• Número de vacas: Se deben tomar muestras de un mínimo de 12 animales por rebaño para las pruebas a nivel de rebaño (descripción de la prueba en la sección de interpretación de la prueba más adelante). Puede ser una mezcla de novillas y vacas de >2 paridades.
• Muestras agrupadas: NO se recomienda agrupar muestras individuales de vacas para evaluar el estado energético de un rebaño. Los estudios realizados en la Universidad de Cornell han demostrado que los resultados de las muestras agrupadas son menos sensibles que las pruebas individuales de las vacas (un mínimo de 12 animales por rebaño) cuando se utiliza el NEFA antes o después del parto para la detección de un balance energético negativo excesivo en las vacas lecheras en transición.

Interferencias

• Lipemia, ictericia: Efecto desconocido (raro en el ganado).
• Hemólisis: Dependiendo del método utilizado por el laboratorio, la hemólisis disminuirá o aumentará los valores de NEFA. En el metodo en blanco usado en la Universidad de Cornell, la hemolisis severa (indice hemolitico > 800 unidades) disminuira levemente las concentraciones de NEFA en la sangre bovina. Las interferencias lipémicas e ictéricas no afectan sustancialmente la concentración de NEFAs con los métodos utilizados por la Universidad de Cornell.
• Excitación/ejercicio/estrés: Estas condiciones, que inducen la liberación de catecolaminas o ACTH, aumentan las concentraciones de NEFAs al estimular la lipólisis a través de la lipasa sensible a las hormonas. Estas condiciones deben reducirse al mínimo cuando se tomen muestras de sangre para la medición de NEFA.
• Momento de la toma de muestras: Es probable que los valores de NEFA sean más altos en las vacas que están llegando para la alimentación diaria (probablemente estén en algún grado de balance energético negativo) frente a las vacas que acaban de ser alimentadas (la lipólisis estará inhibida en estas últimas vacas). Se recomienda la recogida justo antes de la alimentación.

Interpretación de la prueba

La prueba de NEFA se realiza principalmente en el ganado lechero para determinar si el rebaño tiene un balance energético negativo excesivo. Se utiliza más como una prueba a nivel de rebaño que a nivel de animal individual y los resultados se interpretan con respecto a una concentración de corte o porcentaje de animales con valores por encima del corte frente a valores por encima del límite superior de referencia. La medición de NEFA puede hacerse en cualquier otra especie como marcador de un balance energético negativo excesivo. Esto se hace con mayor frecuencia en camélidos (que desarrollan lipidosis hepática en estas circunstancias), otros rumiantes (por ejemplo, cabras, ovejas) para determinar si están en riesgo de cetosis, y caballos (con síndrome metabólico equino). Obsérvese que las concentraciones por debajo del límite de referencia no son clínicamente relevantes.

Centraciones aumentadas

• Fisiológicas: El ejercicio induce la liberación de catecolaminas y ACTH, lo que estimula la actividad hidrolítica de la lipasa sensible a las hormonas para promover la movilización de la grasa con el fin de satisfacer el exceso de necesidades energéticas. Este proceso aumenta la concentración de NEFAs en sangre.
• Diferencias de raza: Varios estudios han demostrado que los NEFAs son más bajos en las vacas Jersey después del parto en comparación con las vacas Holstein, por lo que las directrices desarrolladas para las vacas Holstein (véase más adelante) pueden no ser aplicables a las Jerseys (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Balance energético negativo en las vacas lecheras: Las vacas lecheras en el periodo periparto (de transición) están siempre en un estado de balance energético negativo debido a las altas demandas de energía del feto en desarrollo y de la producción de leche (particularmente con el énfasis en la selección de altas productoras de leche). Sin embargo, este estado de balance energético negativo puede ser excesivo y las vacas afectadas corren el riesgo de padecer enfermedades gastrointestinales (abomaso desplazado), metabólicas (cetosis clínica) e infecciosas (por ejemplo, metritis) en el período posparto temprano. Por lo tanto, los profesionales de la lechería frecuentemente monitorean los rebaños lecheros por exceso de balance energético negativo mediante pruebas de NEFAs, ya sea solo en vacas pre o post parto o como un componente de un perfil metabólico en vacas post parto. Los resultados de estas pruebas pueden ser interpretados a nivel de vaca individual (es decir, un valor de NEFA por encima de un determinado punto de corte indica un exceso de balance energético negativo) o a nivel de rebaño (es decir, una proporción de vacas analizadas tienen valores de NEFA por encima de un determinado valor de corte). La identificación de un exceso de balance energético negativo en vacas individuales (y, lo que es más importante, en el rebaño) indica la necesidad de realizar cambios en la nutrición (por ejemplo, aumentar el espacio de alimentación en la litera, aumentar la densidad energética de la ración) y el manejo de las vacas de transición para disminuir las demandas energéticas y el estrés de las vacas de transición. Las siguientes pautas de interpretación se basan en estudios realizados en la Universidad de Cornell y son válidas para muestras tomadas de vacas Holstein alimentadas con TMR «en riesgo» entre 2-14 días antes del parto (NEFAs preparto) o 3-14 días después del parto (NEFAs postparto). Se recomienda muestrear al menos 12 vacas «de riesgo» cuando se evalúen rebaños alimentados con ración mixta total (TMR) para detectar cetosis subclínica (Ospina et al 2013).
  • Pruebas a nivel de vaca
    • NEAF preparto: Hay una mayor incidencia de enfermedades posparto (abomaso desplazado, metritis/placenta retenida y cetosis clínica), disminución de la producción de leche y disminución del rendimiento reproductivo en los primeros 30 días en leche en vacas lecheras Holstein (alimentadas con TMR) con valores de NEFA > 0,30 mEq/L cuando se analizan de 2 a 14 días antes del parto.
    • NEFAs posparto: Hay una mayor incidencia de enfermedades postparto (abomaso desplazado, metritis/retención de placenta y cetosis clínica), disminución de la producción de leche y disminución del rendimiento reproductivo en los primeros 30 días en leche en vacas lecheras Holstein (alimentadas con TMR) con valores de NEFA > 0,60-0,70 mEq/L cuando se analizan 3-14 días después del parto. En los estudios de Cornell, los NEFAs post-parto fueron en realidad un mejor predictor que las concentraciones de β-hidroxibutirato post-parto o los NEFAs pre-parto.
  • Pruebas a nivel de rebaño
    • NEFAs pre-parto: A nivel de rebaño, hay un riesgo significativamente mayor de enfermedades metabólicas e infecciosas post-parto, disminución de la producción de leche o disminución del rendimiento reproductivo si >15% de las vacas pre-parto analizadas tienen valores de NEFA > 0,30 mEq/L. Nótese que, como se ha indicado anteriormente, no se recomienda la agrupación de muestras de vacas individuales para las pruebas a nivel de rebaño.
    • NEFAs posparto: A nivel de rebaño, hay un riesgo significativamente mayor de enfermedades metabólicas e infecciosas post-parto, disminución de la producción de leche o disminución del rendimiento reproductivo si >15-20% de las vacas post-parto analizadas tienen valores de NEFA > 0,70 mEq/L. Nótese que, como se ha indicado anteriormente, no se recomienda agrupar muestras de vacas individuales para realizar pruebas a nivel de rebaño.
• Lipidosis hepática en ganado lechero: En un estudio, una relación NEFA:colesterol >0,2 (unidades del SI) tenía una relación de probabilidades de 9,9 de que un animal tuviera lipidosis hepática (definida como >10% de contenido de lípidos en el hígado), siendo este punto de corte más sensible (63% con 85% de especificidad) que el BHB, el NEFA solo o la actividad AST (>120 U/L) para el diagnóstico de la lipidosis hepática (basado en el área bajo la curva de características operativas del receptor o AUC). Sin embargo, a los animales de este estudio se les hicieron mediciones de sangre en varios momentos después de la lactancia (Mostafavi et al 2013).
• Balance energético negativo en animales pequeños: Esto ocurre principalmente en la diabetes mellitus. En un estado de deficiencia de insulina o resistencia a la insulina se pierde la inhibición de la lipasa sensible a las hormonas. Un desequilibrio regulador de la actividad de la lipasa hormono-sensible aumenta la movilización de grasa desde el tejido adiposo al tejido hepático, elevando la concentración de NEFAs.
• Balance energético negativo en camélidos: Los camélidos enfermos y estresados, especialmente las hembras preñadas, corren el riesgo de desarrollar lipidosis hepática. La medida de NEFA puede ser hecha para determinar si ellos están en el equilibrio de energía negativo. Los camélidos con NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist et al 2001) tienen mayor riesgo de lipidosis. Los camélidos anoréxicos frecuentemente tienen NEFAs que están aumentados pero por debajo de este valor y pueden no desarrollar lipidosis.