Los Morpholino oligos son herramientas avanzadas para bloquear sitios en el ARN para obstruir procesos celulares. Un oligo morfolino se une específicamente a su sitio objetivo seleccionado para bloquear el acceso de los componentes celulares a ese sitio objetivo. Esta propiedad puede aprovecharse para bloquear la traducción, bloquear el empalme, bloquear los miARN o sus dianas y bloquear la actividad de las ribozimas.
Bloqueo de la traducción: Al bloquear estéricamente el complejo de iniciación de la traducción, los morfolinos pueden anular la expresión de muchas secuencias diana de forma tan completa que, tras esperar a que la proteína existente se degrade, la banda de la proteína diana desaparece de los Western blots. A diferencia de muchos tipos de antisentido (por ejemplo, siRNA, fosforotioatos), los Morfolinos generalmente no causan la degradación de sus objetivos de ARN; en cambio, bloquean la actividad biológica del ARN objetivo hasta que ese ARN se degrada de forma natural, lo que libera el Morfolino. Esto significa que la RT-PCR no es adecuada para evaluar el bloqueo de la traducción por parte de los morfolinos.
Bloqueo del empalme: Al bloquear los sitios implicados en el empalme del pre-ARNm, los Morfolinos pueden utilizarse para modificar y controlar los eventos normales de empalme. Esta actividad puede evaluarse convenientemente mediante la RT-PCR, y la modificación del empalme se traduce en cambios en la banda del producto de la RT-PCR en un gel electroforético. La banda puede desplazarse a una nueva masa o, si la modificación del empalme desencadena una decadencia del transcrito mediada por el sinsentido, la banda del empalme salvaje perderá intensidad o desaparecerá.
Al igual que todos los reactivos de eliminación de genes, los morfolinos deben administrarse activamente en la mayoría de las células. Los morfolinos pueden introducirse en las células cultivadas mediante diversos métodos, como la carga por raspado de células adherentes, la electroporación e incluso la microinyección. Sin embargo, nuestro reactivo Endo-Porter generalmente proporciona una entrega excelente en las células cultivadas en términos de la cantidad de Morfolino entregada por célula, la distribución uniforme a través de una población de células, la reproducibilidad de la entrega y la no toxicidad para la mayoría de los tipos de células en la concentración recomendada. Para los experimentos con animales, nuestros Morfolinos Vivo con su fracción de entrega unida entran en las células desde la sangre tras la administración i.v. o entran en las células de los tejidos que rodean a las inyecciones locales; también son los oligos antisentido más convenientes para su uso en cultivos o explantes celulares, ya que no requieren ningún agente adicional para la entrega citosólica.
Un oligo morfolino es radicalmente diferente de los ácidos nucleicos naturales, con anillos de metilenmorfolina que sustituyen a las partes de azúcar de ribosa o desoxirribosa y enlaces de fosforodiamidato no iónicos que sustituyen a los fosfatos aniónicos del ADN y el ARN. Cada anillo de morfolina posiciona adecuadamente una de las bases estándar del ADN (A, C, G, T) para el emparejamiento, de modo que un oligo de 25 bases de Morpholino se une fuerte y específicamente a su sitio objetivo complementario de 25 bases en una cadena de ARN a través del emparejamiento Watson-Crick. Debido a que la columna vertebral sin carga del Morpholino oligo no es reconocida por las enzimas, es completamente estable a las nucleasas.
Le animamos a que aporte una herramienta más precisa y potente a sus retos experimentales. Llame a nuestro grupo de atención al cliente de nivel de doctorado en Gene Tools para empezar a utilizar los Morfolinos en sus estudios. Teléfono: (541) 929-7840 ext. 1.
- Evaluación de la entrega
- Solubilidad y Morfolinos
Como con todos los agentes de knockdown de genes, la entrega efectiva de los morfolinos es crucial. Mientras que confirmar la entrega no es crucial para los experimentos que utilizan la microinyección embrionaria, confirmar la entrega es importante para los experimentos con células cultivadas. Nuestro reactivo de entrega Endo-Porter generalmente proporciona una entrega sencilla y fiable para la mayoría de los tipos de células. Puede evaluar si está obteniendo una buena entrega en el citosol de sus células utilizando un Morpholino marcado con fluorescencia. Le recomendamos que utilice nuestro económico oligo de control estándar marcado con fluoresceína para este fin.
Cuando utilice un Morpholino fluorescente para confirmar la entrega, comience con una concentración de 10 microMolar de Morpholino oligo en el medio de cultivo. Esta es una concentración lo suficientemente alta como para que después de 16 horas el Morfolino marcado con fluorescencia sea visible en el citosol mediante microscopía de fluorescencia. Un microscopio fluorescente invertido es la mejor opción para observar las células en las placas de cultivo. Observe las células vivas (sin fijar). Utilice un objetivo seco con la mayor apertura numérica disponible para recoger la mayor cantidad de luz posible de las células. La entrega exitosa se manifiesta por una fluorescencia difusa en todo el citosol. La fluorescencia punteada suele indicar que el oligo está atrapado en los endosomas, así que ignore los puntos punteados y busque la fluorescencia difusa.
Para los experimentos reales de entrega de su Morpholino de secuencia personalizada con Endo-Porter generalmente se necesita una concentración de sólo 1 a 5 microMolar para el bloqueo estérico eficaz de la mayoría de los ARNm.
Aunque los oligos Morfolinos son mucho más solubles que otros tipos estructurales no iónicos (como los PNAs), algunos Morfolinos con alto contenido de G (>30%) tienen una solubilidad limitada. Además, la unión de nuestro fluor de lisamina que emite rojo a veces disminuye la solubilidad del oligo. La solubilidad varía con la secuencia del oligo y es difícil de predecir. Las siguientes recomendaciones pueden ayudar a mantener la actividad del oligo si su secuencia tiene poca solubilidad.
Para el almacenamiento a largo plazo, sus soluciones madre de Morpholino se almacenan mejor liofilizadas, La siguiente mejor opción es el almacenamiento en solución a temperatura ambiente. Hacer las soluciones madre de Morpholino a 1 miliMolar o menos ayuda a evitar problemas de solubilidad. Los ciclos de congelación-descongelación o el almacenamiento a largo plazo a 4C pueden provocar la precipitación o la asociación de Morfolinos en un recipiente y disminuir la actividad de la solución; recomendamos el almacenamiento a temperatura ambiente en recipientes bien cerrados y, para evitar la evaporación en caso de que el cierre del vial sea defectuoso, es prudente almacenar las existencias en un entorno húmedo como un humidor (por ejemplo, un frasco de campana con un vaso de agua abierto). Tenga cuidado de evitar que el oligo se seque, ya que puede ser difícil o imposible volver a disolver un oligo desecado (aunque los oligos liofilizados se disuelven con bastante facilidad). Mantener el vial en una caja oscura o envuelto en papel de aluminio es una buena práctica, ya que los oligos marcados con flúor pueden sufrir fotoblanqueo con la luz.
La agregación en la solución puede causar una disminución de la actividad biológica con el tiempo y esto puede ocurrir en soluciones almacenadas a temperatura ambiente. Esto puede revertirse en algunos casos calentando 5 minutos a 65C o, en la mayoría de los casos, esterilizando en autoclave (utilice el ciclo de líquido). Los oligos son muy estables al calor y pueden tolerar varias rondas de autoclavado sin degradarse. A menudo, el autoclavado revivirá un stock que ha perdido algo de actividad debido a la agregación del oligo.
El ARN, el ARN y la mayoría de los reactivos de eliminación de genes se almacenan normalmente en un baño de hielo durante los experimentos para minimizar la degradación por nucleasas. Dado que los Morfolinos son completamente resistentes a la degradación enzimática y que las soluciones acuosas son químicamente estables de forma indefinida (años) a temperatura ambiente, le recomendamos que durante sus experimentos mantenga sus soluciones madre de Morfolinos a temperatura ambiente. Si enfría sus soluciones madre en un baño de hielo, simplemente corre el riesgo de que el Morpholino se precipite.
Estas precauciones son más que necesarias para la mayoría de las secuencias, pero su uso rutinario ayuda a evitar sorpresas desagradables en caso de que encuentre una secuencia con baja solubilidad.