Introducción

4-hidroxi-l-prolina (hidroxiprolina) es un aminoácido no proteinogénico, que tiene un peso molecular de 131,13g/mol y se sintetiza por hidroxilación postraduccional de la prolina durante la biosíntesis del colágeno (Fig. 1). Las investigaciones sobre el metabolismo fisiológico y patológico del colágeno suelen utilizar mediciones de hidroxiprolina en el plasma, la orina y los tejidos corporales. Por lo tanto, la determinación de la hidroxiprolina proporciona información útil para el diagnóstico y el pronóstico de enfermedades causadas por trastornos del metabolismo del colágeno (1). Entre estas enfermedades se encuentran el hipertiroidismo, el hiperparatiroidismo, la acromegalia, la enfermedad de Paget, la osteomalacia, el raquitismo, el síndrome de Marfan, la osteogénesis imperfecta, la esclerodactilia, la dermatomiositis y el síndrome de Cushing (2).

La fibrosis que se produce en el hígado, los pulmones, los riñones, la piel y otros órganos tiene la capacidad de transformarse en una hepatitis crónica, esclerosis hepática, cáncer de hígado, fibrosis pulmonar yglomerulonefritis (3). Por lo tanto, es muy importante prevenir el desarrollo y reducir la gravedad de la fibrosis en los pacientes. La hidroxiprolina actúa como un importante indicador de diagnóstico de la gravedad de la fibrosis.

La medición de la hidroxiprolina en el plasma, la orina y el tejido corporal es posible mediante métodos colorimétricos, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y análisis de inyección de flujo (4-6). Sin embargo, estos métodos requieren grandes volúmenes de muestra, debido a su baja sensibilidad. Además, la HPLC requiere un largo tiempo de separación para cada muestra. En los últimos años, la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) ha surgido como ventajosa por su alta sensibilidad y corto tiempo de separación.LC-MS se ha utilizado para medir bajas concentraciones de drogas en el inserto y la orina con sustancias contaminadas (7-9). El presente estudio tiene como objetivo aplicar el novedoso método de LC-MS a la medición de hidroxiprolina. Como indicador de la fibrosis, se midió la hidroxiprolina en el hígado y el pulmón de un modelo de rata con fibrosis mediante LC-MS, y se comparó con los resultados anteriores obtenidos por métodos de HPLC y colorimétricos.

Materiales y métodos

Declaración ética

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Harbin (Harbin, China). Se incluyó en el protocolo un procedimiento estándar para obtener el consentimiento informado por escrito, que fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Harbin.

Reactivos

La dimetilnitrosamina (DMN) y la hidroxiprolina se obtuvieron de Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japón). El nembutal se compró a Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japón) y lableomicina se obtuvo de Nihon Kayaku Inc. (Tokio, Japón). Todos los demás productos químicos eran de grado reactivo.

Preparación de un modelo de fibrosis pulmonar y hepática en ratas

Se creó un modelo de fibrosis pulmonar en ratas Wistar de cinco semanas mediante la inyección de bleomicina (BLM, 0,30U/100 g, i.Las ratas sanas fueron inyectadas con solución salina al 0,9% (control).

Se creó un modelo de fibrosis hepática en ratas Wistar de siete semanas mediante una única inyección de DMN (40 mg/kg, i.p.). Las ratas sanas normales fueron los controles y se les inyectó solución salina al 0,9% (control). La preparación del modelo de fibrosis pulmonar y del tejido recogido se basó en los métodos descritos en estudios anteriores (10,11).

Medición de la hidroxiprolina en un modelo de rata de fibrosis pulmonar mediante un método colorimétrico

Se extrajo el pulmón izquierdo, se pesó (~0.3 g) y se homogeneizó en una solución de ácido tricloroacético al 5% (volumen x10) utilizando un homogeneizador de células (Eilard, Berlín, Alemania) a 8.000 × g (4°C) durante 2 minutos en un baño de hielo. Las células se centrifugaron (2.500 × g, 4°C) durante 20 minutos y el sobrenadante se lavó dos veces con agua destilada. A continuación, se añadió HCl 6 N a 110°C por completo al principio y se hizo reaccionar durante 16 h. Una vez completada la reacción, se añadió tolueno (3 ml) y se agitó la mezcla durante 20 min. Tras la centrifugación (3.000 × g, 20°C) durante 10 minutos, se recogió la capa orgánica y se añadió p-dimetilaminobenzaldehído.La hidroxiprolina de la muestra se detectó utilizando un Espectrómetro Multiplaca (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a 560 nm.

Medición de la hidroxiprolina en el hígado por HPLC

Se extrajo el pulmón izquierdo, se pesó (~0,3 g) y se homogeneizó en 5 ml de etanol utilizando un homogeneizador de células (Eilard) a8.000 × g (4°C) durante 2 minutos en un baño de hielo. El homogeneizado se centrifugó (2.500 × g, 4°C) durante 20 minutos y se recogió el sobrenadante. Se obtuvo el líquido (1 ml) y se calentó durante 8 h a60°C hasta que se secó. Tras disolver el residuo en 40 μl de etanol y 80 μl de tampón de borato (0,1 M, pH 8), se añadieron 40 μl de 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan (100 mM) como reactivo de fluorescencia. Se dejó que la reacción continuara a temperatura ambiente durante 15 h en la oscuridad. A continuación, se añadieron 840 μl de ácido clorhídrico (6 mol/l) para terminar la reacción. Tras la centrifugación (2.500 × g, 20°C) durante 20 minutos, se extrajo el sobrenadante para el análisis por HPLC.

Se utilizó un sistema HPLC Hitachi L6000 (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, EE.UU.).La detección se realizó con un espectrómetro de fluorescencia Hitachi L7480 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japón; excitación a 475 nm, emisión a 530 nm). La columna (Hitachi High-Technologies Corporation) era una YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) a temperatura ambiente. La fase móvil fue acetonitrilo: agua (gradiente 35:65-50:50 durante 15 min) y el caudal fue de 1ml/min.

Medición de la hidroxiprolina en la organización pulmonar y hepática mediante LC-MS

Se extrajo el pulmón izquierdo, se pesó (~0.3 g) y se homogeneizó en una solución de ácido tricloroacético al 5% (volumen x10) utilizando un homogeneizador de células (Eilard) a 8.000 × g (4°C) durante 2 minutos en un baño de hielo. Las células se centrifugaron (2.500 × g, 4°C) durante 20 minutos. El sobrenadante se lavó dos veces con agua destilada. A continuación, se añadió HCl 6 N a 110°C durante 16 h y se prepararon las muestras para su medición. Se extrajo el hígado, se pesó (~0,3 g) y se homogeneizó en 5 ml de etanol utilizando un homogeneizador de células (Eilard) a 8.000 × g (4°C) durante 2 minutos en un baño de hielo. El homogeneizado se centrifugó (2.500 × g, 4°C) durante 20 minutos, se recogió el sobrenadante y se prepararon las muestras para la medición.

La concentración de hidroxiprolina se determinó siguiendo un método de LC-MS utilizando un sistema LC-MS2020 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón). Con respecto a la LC, la fase móvil fue 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. La columna era Shin-pack VP-ODS (150×2 mm de diámetro). El caudal fue de 0,2 ml/min. En cuanto a la EM, se empleó la ionización química atmosférica (APCI). También se utilizó la detección de iones positivos. El voltaje de la sonda de electrones fue de 4,5 kV y la corriente de la sonda fue de 4,2 μA. La temperatura de la sonda APCI fue de 250°C y el voltaje del electrón de la línea de desolvatación curva (CDL) fue de -30,0 V. La temperatura de la CDL fue de 250°C y la temperatura del bloque de 20°C. La tensión de polarización para las matrices Q 1, 2 y 3 fue de 5,0, 25,0 y 35,0 V, respectivamente. La tensión de electrones de RF de la matriz Q fue de 150,0 V.

Análisis estadístico

Las diferencias entre los grupos se examinaron mediante un análisis de varianza de una vía. Si no se observó una diferencia significativa, la diferencia entre los grupos se examinó mediante el método de Bonferroni. Las correlaciones se examinaron mediante una prueba de dos caras. Se consideró que P<0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Medición de la concentración de hidroxiprolina por LC-MS

Cromatograma de MS de la hidroxiprolina

El espectro de masas de la hidroxiprolina se muestra en la Fig. 2. La EM del estándar de hidroxiprolina (80 pg/ml) dio lugar a picos de fragmentos con una masa molecular de 173,0 (ion molecular + ácido acético-agua) generados a partir de la adición al ácido acético amónico para aumentar el número de moléculas iónicas (cantidad molecular, 131,15) y la fuerza iónica.

Cromatograma de LC-MS de hidroxiprolina

Las condiciones de LC fueron las siguientes: Fase móvil, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; columna,Shin-pack VP-ODS (150×2 mm de diámetro); caudal, 0,2 ml/min y detecciónultravioleta (UV) a 230 nm. La EM se realizó utilizando el método de ionización APCI y la detección de iones fue positiva.

El cromatograma LC-MS de monitorización de iones seleccionados (SIM) de la hidroxiprolina (m/z, 173,0) se presenta en la Fig. 3. Como se observó para el estándar de hidroxiprolina, se observó un pico a 1 ng/ml con un tiempo de retención de 2,213 min. También se observó un pico agudo a 50 ng/ml. A 1 μg/ml, que era 1.000× la concentración estándar, se observó un pequeño pico en el espectro LC-UV (230 nm).

Sensibilidad de la detección LC-MS a la hidroxiprolina

La curva estándar LC-MS-SIM de la hidroxiprolina (m/z, 173,0; ion molecular + ácido acético-agua) se muestra en laFig. 4. Utilizando el método de área de pico para la curva estándar, la hidroxiprolina mostró un pico agudo a 35ng/ml (Fig. 3). Sin embargo, a concentraciones <35 ng/ml, no se observó una correlación entre las áreas de los picos. A partir de 35-560 ng/ml, se observó una correlación entre las áreas de los picos y la curva estándar fue una línea recta. A 60 y 80 μg/ml, las áreas de los picos eran casi idénticas. No se observó una correlación entre las áreas de pico a concentraciones >60 μg/ml.

Cromatograma de LC-MS y espectro de MS de hidroxiprolina en un modelo de fibrosis pulmonar y hepática en ratas

La Fig. 5 muestra el cromatograma de LC-MS y el espectro de MS con detección SIM de hidroxiprolina (m/z 173,0; ion molecular + ácido acético-agua) en un modelo pulmonar de fibrosis en ratas. En el cromatograma LC-MS del pulmón, similar al del estándar de hidroxiprolina, se observó un pico distinto a m/z 173,0 con un tiempo de retención de 2.213 min. La hidroxiprolina se identificó a m/z 131,15 en el espectro de masas.

La Fig. 6 ilustra el cromatograma LC-MS y el espectro MS con detección SIM de hidroxiprolina (m/z 173,0; ion molecular + ácido acético-agua) en el tejido hepático fibrótico de las ratas. Como se observó en el caso del estándar de hidroxiprolina, se observó un pico con un tiempo de retención de 2,213 minutos en el cromatograma LC-MS y en el espectro MS.

Concentración de hidroxiprolina en el tejido pulmonar (métodos colorimétrico y LC-MS)

En la Fig. 7 se comparan los métodos colorimétrico y LC-MS empleados para la determinación de la concentración de hidroxiprolina en el tejido pulmonar de rata.Cada columna representa la media ± desviación estándar de nueve experimentos. Según el método colorimétrico, la concentración de hidroxiprolina en el tejido pulmonar de rata del grupo infundido con BLM (652,3±70,0 μg/pulmón izquierdo) fue significativamente superior a la del grupo de control (547,1±52,3 μg/pulmón izquierdo; P<0,05). Según el método LC-MS, el grupo infundido con BLM (610,9±50,3 μg/pulmón izquierdo) tenía un valor significativamente mayor en comparación con el grupo de control (493,3±53,5 μg/pulmón izquierdo; P<0,05).Sin embargo, la concentración de hidroxiprolina en el tejido pulmonar de rata medida por el método LC-MS tenía un valor más bajo comparado con el medido por el método colorimétrico.

Las concentraciones de hidroxiprolina en el tejido pulmonar de rata medidas por los métodos colorimétrico y LC-MS se comparan en la Fig. 8. Se identificó una correlación entre los métodos colorimétrico y LC-MS para la determinación de la concentración de hidroxiprolina en el tejido pulmonar del grupo de control (r=0,972). Del mismo modo, se identificó una correlación entre los métodos colorimétricos y de LC-MS para la determinación de la concentración de hidroxiprolina en el tejido pulmonar del grupo infundido con BLM (r=0,918).

Concentración de hidroxiprolina en el tejido hepático de rata mediante los métodos de etiquetado de fluorescencia y LC-MS

La evaluación de la concentración de hidroxiprolina en el tejido hepático de rata mediante los métodos de etiquetado de fluorescencia y LC-MS se ilustra en la Fig. 9. De acuerdo con el método de etiquetado de fluorescencia, la concentración de hidroxiprolina en el tejido del hígado de rata del grupo infundido con DMN (105,4±36,5 μg/g) fue significativamente mayor en comparación con la del grupo de control (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). También según el análisis de CL-MS, el grupo infundido con DMN (190,4±70,3 μg/g) demostró un valor significativamente mayor en comparación con el grupo de control (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Sin embargo, la concentración de hidroxiprolina en el tejido de hígado de rata medida por LC-MS fue más alta en comparación con la medida por el método de etiquetado de fluorescencia.

La concentración de hidroxiprolina en el tejido de hígado de rata evaluada por los métodos de etiquetado de fluorescencia y LC-MS están correlacionados en la Fig. 10. La concentración de hidroxiprolina en el tejido hepático del grupo de control evaluado mediante el etiquetado por fluorescencia se correlacionó con la obtenida mediante el método LC-MS (r=0,957). Asimismo, la concentración de hidroxiprolina en el tejido hepático del grupo infundido con DMN obtenida por el método de etiquetado de fluorescencia se correlacionó con la obtenida mediante el método LC-MS (r=0,981).

Discusión

La hidroxiprolina es un tipo de aminoácido que se encuentra en el albúmina. El residuo de prolina en la proteína es hidroxilado por la 4-monooxigenasa para generar el ácido 4-hidroxi-2-oxoglutal, que se convierte en alanina y glicina a través del ácido 4-glutámico en el cuerpo humano. En cada órgano interno del cuerpo, la inflamación y el fibrosismo pueden dar lugar a la acumulación de componentes de la matriz extracelular (MEC) (12). Sin embargo, en condiciones patológicas, puede producirse una fibrosis adicional en el hígado, los pulmones y los riñones (13,14).La hepatitis crónica y la esclerosis hepática se asocian a la fibrosis y también tienen una estrecha correlación con el cáncer de hígado (15).

En los pulmones, la gravedad de la fibrosis depende del tipo de neumonía (16).Normalmente, la fibrosis pulmonar acompaña a la neumonía intersticial(17). La fibrosis en los órganos internos está causada por la proliferación de los componentes de la MEC depositados por los miofibroblastos. La comprensión del desarrollo de la fibrosis implica el examen de la concentración de colágeno. La concentración de hidroxiprolina se asocia al colágeno como indicador de la gravedad de la fibrosis (18-20). La hidroxiprolina es importante como índice de la enfermedad causada por la proliferación de colágeno (como la infibrosis) y el mal funcionamiento del metabolismo.

En los últimos años, se ha demostrado que la LC-MS es un método de detección muy sensible (7,8,21).La LC-MS comprende un componente de LC y otro de MS, y la interfaz que los conecta. La parte de LC es idéntica a la de HPLC convencional. La muestra es ionizada por la sección de la interfaz. La ionización por termopulverización producía productos inestables (volátiles), por lo que se utilizó la APCI (que ioniza el material, pero no el disolvente, tras la nebulización con disolvente a presión atmosférica). La ionización por electrospray (ESI) puede utilizarse para ionizar moléculas de alta polaridad y alto peso molecular, lo que es ideal para el componente de interfaz.Sin embargo, en el presente estudio, la ESI no se adaptó para tematizar la medición de la hidroxiprolina en muestras corporales, ya que la ESI no fue acompañada por el termospray en caso de ionización. Fue un procedimiento más sencillo medir la hidroxiprolina combinada con Na+ añadiendo Na+ adicional a la muestra.

El espectro de EM de la hidroxiprolina demostró picos de m/z 173,0 y 131,15. El m/z 173,0 se identificó como el pico que representaba la sal de ácido acético procedente del amonio del ácido acético que se añadió a la fase móvil para aumentar la fuerza iónica. Además, debido a que la fuerza comparativa de m/z 131,15 y 173,0 es aproximadamente idéntica en el espectro de la EM, el ion de m/z 173,0 fue elegido por la SIM en el cromatograma de la EM para evitar el pico de interferencia de la fase móvil.

En el cromatograma de la EM del estándar de hidroxiprolina a 1 ng/ml, se observó un pico en la medición de la SIM con m/z 173,0. En el espectro UV (230 nm) de la hidroxiprolina a 1 μg/ml, que era 1.000× la concentración estándar, se observó un pequeño pico (la medición se realizó al mismo tiempo que la medición LC).

En las concentraciones <35 ng/ml, entre las áreas de los picos, no se observó una fuerte correlación entre los diferentes métodos, y no fue posible crear una curva estándar. Se hipotetizó que el analito podría haberse visto afectado por el pico de la fase móvil, ya que la hidroxiprolina tiene un peso molecular comparativamente bajo (131,15). Además, el tiempo de retención del pico puede haberse vuelto inestable debido a la polaridad del disolvente a bajas concentraciones (concentración de hidroxiprolina <35 ng/ml).

Se planteó la hipótesis de que podría ser posible medir concentraciones de sustancias tan bajas como el nivel de pg/ml. Para el pico de hidroxiprolina en el cromatograma de EM, el tiempo de retención fue corto (2,213 min). La capacidad de retención de la hidroxiprolina en la columna ODS era más débil de lo que se había propuesto en un principio. La fuerza iónica relativa en el espectro de EM a m/z 131,15 y 173,0 era aproximadamente idéntica y, por consiguiente, el pico de interferencia de la fase móvil eligió un ion de m/z173,0. En el cromatograma LC-MS de la hidroxiprolina en el tejido pulmonar y hepático, se observó un pico agudo de m/z 173,0 con un tiempo de retención de 2,213 minutos, al igual que para el estándar de hidroxiprolina. Con respecto al espectro de EM, se confirmó el pico de iones moleculares de la hidroxiprolina (m/z 131,15).

La medición de la concentración de hidroxiprolina en los tejidos de pulmón e hígado mediante LC-MS se comparó con la obtenida por el método colorimétrico, así como por un método de fluorescencia mediante HPLC de un estudio anterior de nuestro grupo. Se observó una correlación positiva altamente significativa. Sin embargo, el valor de la concentración de hidroxiprolina en el pulmón obtenido por el método colorimétrico es mayor que el obtenido por LC-MS. Además, la concentración de hidroxiprolina en el hígado obtenida por el método de fluorescencia mediante HPLC fue menor en comparación con el valor obtenido por LC-MS (que se suponía que era una absorbencia alta de todos los componentes de la muestra a una longitud de onda constante de 560 nm).

En conclusión, la hidroxiprolina, como indicador de la fibrosis, se midió mediante métodos colorimétricos y HPLC en estudios anteriores de nuestro grupo. En comparación, el presente estudio identificó que el método LC-MS era más ventajoso, caracterizado por su proceso simple, alta sensibilidad (nivel de pg) y corto tiempo de separación. Se justifica la realización de nuevas investigaciones con muestras de mayor tamaño para confirmar estos resultados.

Agradecimientos

Los autores agradecen a M. Kusunose, M. Ono yA. Hamada (Departamento de Farmacia, Escuela de Medicina de Kochi, Japón) por proporcionar varios reactivos utilizados en este estudio, sugerencias útiles y experiencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Salud Pública de la provincia de Heilongjiang (nº 2013365) de China.

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