En 1440, el sacerdote, humanista, retórico y orador italiano Lorenzo Valla difundió el manuscrito De falso credita et ementita Constantini Donatione declamatio, en el que demostraba, por motivos históricos y lingüísticos, que la Donación de Constantino era una falsificación. Debido a la oposición de la Iglesia, el ensayo no se publicó formalmente en papel hasta la edición de Ulrich von Hutten de 1517. Se hizo popular entre los protestantes, y en 1534 se publicó una traducción al inglés para Thomas Cromwell. Valla argumentó su caso de forma tan convincente que aún hoy se mantiene, y la ilegitimidad de la Donación de Constantino es generalmente admitida.

Valla demostró que el documento no podía haber sido escrito en la época histórica de Constantino I (siglo IV) porque su estilo vernáculo databa de forma concluyente de una época posterior (siglo VIII). Una de las razones de Valla era que el documento contenía la palabra sátrapa, que él creía que los romanos como Constantino I no habrían utilizado.

Aunque inicialmente fue objeto de grandes críticas, la Donación de Constantino fue aceptada como legítima, especialmente por la naturaleza beneficiosa de su contenido para la iglesia occidental. La Donación de Constantino sugería que Constantino I «donó» todo el Imperio Romano de Occidente a la Iglesia Católica Romana como acto de gratitud por haber sido curado milagrosamente de la lepra por el Papa Silvestre I. Obviamente, esto habría descartado la propia Donación de Pepino el Breve, que otorgó a los lombardos tierras al norte de Roma.

«Valla fue motivado a revelar la Donación de Constantino como un fraude por su empleador de la época, Alfonso de Aragón, que estaba involucrado en un conflicto territorial con los Estados Papales, entonces bajo el Papa Eugenio IV. La Donación de Constantino había sido citada a menudo para apoyar el poder temporal del Papado, desde al menos el siglo XI» (artículo de Wikipedia sobre Lorenzo Valla, consultado el 17-01-2009).