2.2 Estrategias de producción de levan

El levan se sintetiza como un exopolisacárido (EPS) en la matriz extracelular de bacterias de varios géneros, como Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus y Zymomonas (Sarilmiser et al, 2015). Además de estos productores extremófilos de levadura, Poli et al. (2009) reportaron a Halomonas sp. como productor de levadura. Se investigaron otros estudios sobre el uso potencial de Halomonas levan como agente biofloculante (Sam et al., 2011), sistema de administración de fármacos basado en péptidos y proteínas (Sezer et al., 2011, 2015), delgado biocompatible (Sima et al., 2011, 2014), película multicapa adhesiva (Costa et al., 2013) y un glicano imitador de heparina (Erginer et al., 2016). La Fig. 12.2 muestra el proceso general de producción del levan.

Figura 12.2. Pasos básicos del procesamiento posterior del levano.

Los EPS microbianos suelen producirse en sistemas de fermentación aeróbica y sumergida. Las condiciones de fermentación, como la aireación, la agitación, el pH, la concentración de oxígeno disuelto, la temperatura, la composición del medio y el diseño del biorreactor pueden determinar las características del producto y el rendimiento de la producción. Por lo tanto, para lograr una alta calidad y rendimiento de la producción se debe realizar una optimización elaborada de estos parámetros para cada organismo (Öner et al., 2016). Por ejemplo, Srikanth et al. (2015) investigaron los efectos de los parámetros de fermentación, incluyendo el pH inicial, la suplementación de levadura, la concentración de sacarosa, la fuente de nitrógeno, la concentración de inóculo y el tiempo de cultivo en la síntesis de levadura utilizando Acetobacter xylinum NCIM2526 como cepa productora. Las condiciones óptimas se determinaron como 10, 50-60 y 1,49 g/L de nitrógeno, sacarosa e inóculo, respectivamente. El rendimiento de levano aumentó notablemente después de las primeras 24 h y la máxima productividad de levano se obtuvo después de 122 h cuando el pH inicial se fijó en 6,8. El aumento de la suplementación inicial de levano de 0,1 a 0,4 g/L incrementó el rendimiento de levano de 1,22 a 1,65 g/L; todo lo que superó los 0,4 g/L no tuvo mayor incremento en el rendimiento. Las concentraciones de inóculo entre el 5% (v/v) y el 10% (v/v) dieron lugar a un cambio en el rendimiento de la levadura, como se esperaba, y se alcanzó un rendimiento máximo (1,46 g/L) al 7% (v/v). Las concentraciones de sacarosa de 20 a 80 g/L afectaron el rendimiento de levadura. En el rango de 40-50 g/L el rendimiento de producción aumentó, en el rango de 70-80 g/L disminuyó, y en el rango de 20-40 g/L no cambió.

Sarilmiser et al. (2015) estudiaron la producción de levadura en un microorganismo halófilo (Halomonas smyrnensis AAD6T) utilizando varios factores estimulantes. Por ejemplo, se aplicaron varias estrategias de alimentación a diferentes intervalos de tiempo en un sistema de biorreactor discontinuo, y se probaron múltiples condiciones iniciales en cultivos agitados. Entre las diferentes concentraciones de pH y sacarosa probadas, el máximo rendimiento de levadura se alcanzó con pH 7 (1,345 g/L de levadura) y 50 g/L de sacarosa (1,320 g/L de levadura). Cuando se aplicaron limitaciones de nitrógeno y fósforo, tanto la concentración de levan como la biomasa disminuyeron, mientras que los valores de Yp/x aumentaron. Las estrategias de pulso de nitrógeno disminuyeron la síntesis de levan debido al periodo de crecimiento prolongado, las estrategias de pulso de sacarosa mejoraron significativamente el crecimiento celular y la producción de levan, y el pulso de NaCl no tuvo ningún impacto en el crecimiento. Curiosamente, los cultivos realizados en presencia de ácido bórico produjeron las mayores concentraciones de levan (8,84 g/L) en condiciones de biorreactor controlado. Esta mejora se explicó por el fenómeno biológico conocido como detección de quórum (QS), en el que intervienen los átomos de boro; una de las moléculas de señalización implicadas en el QS en H. smyrnensis AAD6T se identificó posteriormente como una C16-acilhomoserinelactona (Abbamondi et al., 2016).

El peso molecular del levan es un factor decisivo para su aplicabilidad en diversas industrias, incluyendo la alimentaria, la cosmética y la médica (Belghith et al., 1996). Determinar las condiciones optimizadas para la producción de levan es vital para obtener el compuesto de peso molecular deseado (Porras-Domínguez et al., 2015). Por ejemplo, Wu et al. (2013) evaluaron sutiles modificaciones en el proceso de producción para adquirir diferentes pesos moleculares de levan en sistemas batch y fed-batch, utilizando Bacillus subtilis (natto) Takahashi como cepa productora. Cuando se aplicaron concentraciones altas (400 g/L) y bajas (20 g/L) de sacarosa, se obtuvieron pesos moleculares de levan más bajos y más altos, respectivamente. Esta relación lineal se atribuyó al efecto de la sacarosa sobre la enzima levansucasa. Los autores concluyeron que el peso molecular del levan dependía de las condiciones de reacción, como el pH, la temperatura, la velocidad de agitación y la sacarosa, siendo esta última el factor más eficaz para determinar el peso molecular del levan.

La producción de levan en sistemas celulares inmovilizados también es ventajosa, ya que dichos sistemas se benefician de procesos posteriores relativamente fáciles, de una alta productividad volumétrica, de un control avanzado del proceso y de un menor riesgo de contaminación en la producción de EPS (Ürküt et al., 2007). La implementación de este método favorable para la producción de levadura puede utilizarse como alternativa a los procesos por lotes, por lotes alimentados y continuos (Öner et al., 2016). Por ejemplo, Silbir et al. (2014) ensayaron la producción de levadura en sistemas de fermentación continua y por lotes utilizando Zymomonas mobilis B-14023. Las producciones de fermentación continua se llevaron a cabo en un biorreactor de lecho empacado empleando células inmovilizadas en Ca-alginato. El tiempo de incubación, el pH inicial y la concentración de sustrato fueron las tres variables de proceso más significativas para la producción de levan en el sistema por lotes. La mayor cantidad de levan (40,2 g/L) se produjo cuando se utilizó el extracto de levadura como fuente de nitrógeno orgánico en los cultivos en frasco agitado. Además, las células inmovilizadas de Z. mobilis en el sistema de fermentación continua se aplicaron con éxito para la producción de levan. Las caídas incontrolables de la presión del sistema y la disrupción de las perlas de gel de Ca-alginato fueron las principales limitaciones para lograr tiempos de fermentación más largos.

A pesar de la diversidad de microorganismos productores de levan, los costes de producción del polisacárido levan siguen siendo elevados. Este es probablemente el mayor cuello de botella en su comercialización (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Los medios de fermentación representan aproximadamente el 50% de los costes de producción de un proceso microbiano (Van Hoek et al., 2003); sin embargo, para la producción microbiana de levadura se han utilizado anteriormente fuentes de carbono baratas, como jarabes y melazas (Özcan y Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) investigaron la melaza de remolacha y la melaza de almidón como sustitutos de la sacarosa en cultivos de Halomonas. Se utilizaron pretratamientos de clarificación, pH, ácido sulfúrico, fosfato tricálcico y carbón activado en diferentes combinaciones para ajustar la disponibilidad química para la producción de levadura. Se llegó a la conclusión de que los rendimientos máximos de levan se alcanzaron con una concentración de 10 g/L de TCPHAC son 4,19 y 3,68 g/L, respectivamente. Al utilizar 30 g/L de TCPHAC y HAC, se lograron rendimientos de levan de 7.56 y 4.44 g/L. La eliminación de los metales pesados y el aumento de la concentración de hierro dieron lugar a una disminución de la integridad celular y del rendimiento de levan en este estudio. En otros estudios, la melaza de caña de azúcar en cultivos de Bacillus lentus V8 (Abou-Taleb et al., 2015), el jarabe de dátiles en cultivos de Mycobacterium levaniformis 1406 (Moosavi-Nasab et al, 2010), melaza de remolacha en cultivos de Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 (Han y Watson, 1992), y melaza y jarabe de caña de azúcar en cultivos de Z. mobilis ATCC 31821 (De Oliveira et al., 2007) fueron investigados como fuentes de carbono de bajo costo para la producción de levano.

La biosíntesis de levano en sistemas de fermentación sumergida están limitados por el requisito de crecimiento celular que puede no cumplir con las condiciones óptimas para una alta actividad de levansucrasa (Santos-Moriano et al., 2015). Sin embargo, los sistemas libres de células eliminan esta limitación y proporcionan beneficios adicionales, como la facilidad de preparación, la reutilización y el control de los cambios microambientales (Jang et al., 2001). Por esta razón, es crucial proporcionar un entorno óptimo para la levansucrasa. Por ejemplo, Lu et al. (2014) examinaron la influencia de varios factores, como la concentración de sustrato, el tiempo de reacción, la temperatura y el pH en la producción de levansucrasa utilizando levansucrasa recombinante en un sistema libre de células. Observaron un rendimiento máximo de levan (7,1 g/L) utilizando sacarosa 0,8 M, pH 6,5 y 40°C durante 24 h. El rendimiento de levan aumentó paralelamente al aumento de la concentración de sacarosa de 0 a 0,8 M. Su estudio mostró que la enzima recombinante presenta propiedades bioquímicas similares a la enzima nativa.