Cultivos celulares y RNAi

La línea celular S2 de Drosophila melanogaster (de la colección de IMG RAS) y la línea celular Kc167 (del Centro de Recursos Genómicos de Drosophila) se cultivaron a 25 °C en medio Drosophila de Schneider (Gibco) suplementado con un 10% de bovino fetal inactivado por calor.suero fetal bovino inactivado (FBS, Gibco), 50 unidades/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Las OSC47 proporcionadas amablemente por M. Siomi se cultivaron en medio para insectos Shields y Sang M3 (Sigma-Aldrich) complementado con 10% de FBS inactivado por calor (Gibco), 10% de extracto de mosca (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml de insulina (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml de glutatión (Sigma-Aldrich), 50 unidades/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Los dsRNAs contra lacZ o lamina Dm0 para el tratamiento con RNAi de las células S2 se prepararon como se describió anteriormente11. Los dsRNAs contra LBR se prepararon de la misma manera utilizando el ADN del genoma de Drosophila como plantilla para la amplificación por PCR y los cebadores proporcionados en la Tabla Suplementaria 1. El tratamiento de las células con dsRNA se llevó a cabo durante cuatro días utilizando un protocolo descrito previamente48.

Análisis de Western-blot

Las proteínas se extrajeron con 8 M de urea, 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,0, 1% de SDS, se fraccionaron mediante SDS-PAGE (gel de acrilamida al 12%) y se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore). Los blots se revelaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma) y el sistema de detección Immun-Star AP (Bio-Rad). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la detección: monoclonal murino anti-lamina Dm0 (1:2000; ADL6749), policlonal de conejo anti-lamina C25 (1:10000), monoclonal murino anti-beta Actina (1:3000; ab8224, Abcam).

Visualización de la cromatina mediante tinción de histona H4 o DAPI

Las células Lam-KD, LBR-KD o el control S2 se sembraron en cubreobjetos durante 30 minutos. Después de enjuagarlas con PBS, las células se fijaron en metanol al 100% durante 5 minutos a temperatura ambiente (para seguir examinando la distribución de la cromatina basándose en la inmunotinción de la histona H4) o en formaldehído al 4% en PBS durante 25 minutos a temperatura ambiente (para seguir estimando el volumen de la cromatina basándose en la tinción con DAPI), se enjuagaron con PBS tres veces, se bloquearon con PBTX (PBS con 0,1% de Tween-20 y 0,3% de Triton X-100) que contenía 3% de suero normal de cabra (Invitrogen) durante 1 h a temperatura ambiente. El resto del procedimiento de inmunotinción se realizó como se ha descrito previamente50. Como anticuerpos primarios utilizamos anti-histona H4 monoclonal murino (1:200; ab31830, Abcam), anti-LBR26 policlonal de cobaya (1:1000), anti-lamina Dm051 policlonal de conejo (1:500). Como anticuerpos secundarios utilizamos IgG anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 546 (Invitrogen) o IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen), o IgG anti-conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 633 (Invitrogen).

Cuantificación en ImageJ de la distribución de la cromatina

Usando ImageJ, medimos los perfiles de la histona H4, LBR y la lámina Dm0 a través del diámetro del núcleo del plano focal ecuatorial de los núcleos de las células Lam-KD, LBR-KD o del control S2. Se extrajeron las intensidades de fluorescencia, los perfiles individuales se normalizaron primero en la intensidad media, luego en el diámetro del núcleo (delimitado por los picos de fluorescencia de LBR para Lam-KD, o por los picos de fluorescencia de lamin Dm0 para LBR-KD) y posteriormente se alinearon para determinar el perfil promediado. Se analizaron los núcleos de 2 ó 3 experimentos independientes (60 núcleos por experimento).

Estimación del volumen de la cromatina teñida con DAPI

Se procesaron y analizaron imágenes focales que contenían entre 20 y 30 células Lam-KD teñidas con DAPI y fijadas con formaldehído o células S2 de control con los mismos parámetros utilizando el software IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG). En las células Lam-KD sólo se utilizaron para el análisis los núcleos con la menor tinción residual de lamin Dm0, mientras que en las células de control, por el contrario, no se tomaron para el análisis los núcleos con escasa tinción de lamin Dm0. Para la sustracción de fondo, las imágenes se umbralizaron a ~15% de la intensidad máxima del canal para que las superficies nucleares generadas no se expandieran más allá del pico de intensidad de la fluorescencia LBR. Con estos parámetros, se reconstruyeron automáticamente las superficies de los núcleos, adecuadas para el análisis. Finalmente, los volúmenes de ~100 núcleos reconstruidos se recuperaron de la pestaña de Estadísticas para el análisis.

FISH bicolor

Las sondas FISH de 20 kb se generaron utilizando un kit de PCR de largo alcance (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) mediante la amplificación por PCR de 4 fragmentos del genoma en mosaico que cubrían la región 2 L:16964000-16982000 o 2 L:17310000-17328000, con el uso de los pares de cebadores proporcionados en la Tabla Suplementaria 1. Se etiquetó 1 µg de ADN molde para la hibridación mediante síntesis de cebadores aleatorios con el kit de etiquetado de ADN DIG (Roche) o mediante ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Las sondas se combinaron e hibridaron con células S2 como se ha descrito anteriormente23. Para la detección de la sonda NL o FISH, como anticuerpos primarios utilizamos el policlonal de cobaya anti-LBR26 (1:1000), o el policlonal de conejo anti-lamina Dm051 (1:500) y el policlonal de oveja anti-DIG-FITC (1:500, Roche). Como anticuerpos secundarios utilizamos IgG de cabra anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 633 (Invitrogen), o IgG de cabra anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 546 (Invitrogen) e IgG de cabra anti-FITC conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen).

Medición de las distancias entre las sondas FISH y la NE

Se registraron pilas de imágenes tridimensionales con un microscopio confocal de barrido láser LSM 510 Meta (Zeiss). Se capturaron secciones ópticas con intervalos de 0,4μm a lo largo del eje Z. Las imágenes se procesaron y analizaron utilizando el software IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) con la configuración experimental ciega. Las distancias entre ambas sondas o entre las sondas y la NE se contaron como se ha descrito previamente23. Brevemente, no pudimos reconstruir completamente las superficies de los núcleos de forma automática basándonos en su inmunotinción LBR o lamin Dm0. Por lo tanto, el borde nuclear de un núcleo en particular se delineó manualmente en todas las secciones ópticas de la pila por la mitad de su tinción LBR o lamin Dm0 para reconstruir aún más la superficie de este núcleo automáticamente. Para determinar la distancia entre las señales FISH y la NE, el «punto de medición» del instrumento se situó en el vóxel más brillante de la sonda FISH y otro «punto de medición» se situó en la superficie nuclear reconstruida en el punto de su intersección más temprana con una esfera que crecía progresivamente desde el primer «punto de medición». Se midió la distancia entre dos «puntos de medición» (es decir, la distancia más corta entre el centro de la sonda FISH y el centro de la NE) para cada núcleo. Las distancias entre dos sondas FISH se midieron de forma correspondiente. Los datos se obtuvieron en dos experimentos independientes para 75-100 núcleos por experimento. Paralelamente, se recuperaron los volúmenes de los núcleos y se calcularon los radios de los mismos considerando que eran esféricos. Finalmente, las distancias se normalizaron a los radios nucleares.

Análisis de la expresión génica

El ARN total se aisló de las células Lam-KD o de las células S2 de control utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen), y el ADN contaminante se eliminó mediante el tratamiento con DNasa I. La calidad del ARN se evaluó mediante electroforesis capilar con un Bioanalyzer 2100 (Agilent). El ARN poli(A)+ se extrajo del ARN total utilizando perlas magnéticas oligo(dT) (Thermo Fisher Scientific). Se utilizó el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra II (New England Biolabs) para preparar las bibliotecas siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas procedentes de dos réplicas biológicas de células Lam-KD o de células S2 de control se cuantificaron utilizando un fluorímetro Qubit y una PCR cuantitativa, y se secuenciaron en el Illumina NextSeq, lo que dio lugar a 8,4-9,4 × 106 lecturas de 80 nt de extremo único. Las lecturas se asignaron al genoma de referencia de D. melanogaster (versión dm3) utilizando HISAT52 v2.1.0 con la opción -max-intronlen 50.000. Las lecturas con baja calidad de mapeo se eliminaron utilizando SAMtools53 con la opción -q 30. Se calcularon los niveles de transcripción log2 en bines genómicos de 20 kb utilizando BEDtools54 v2.16.2 con la opción -split, y luego se aplicó la función hclust en R para agrupar las réplicas utilizando el coeficiente de correlación de 1-Spearman como métrica de distancia. La expresión de los genes se cuantificó con StringTie52 para la versión r5.12 de la anotación de referencia. Se filtraron los genes con expresión cero en más de dos réplicas. Entre los 10.076 genes restantes, los genes expresados diferencialmente se definieron utilizando el paquete edgeR55 con normalización de la media recortada de los valores M (TMM) con un corte FDR = 0,05. Los genes se asignaron a los LADs si sus TSSs estaban localizados dentro de los LADs, mientras que los genes se asignaron a los inter-LADs si sus TSSs estaban al menos a 1kb de distancia de los LADs. Se añadió un pseudoconteo a todos los valores de expresión para eliminar los ceros. El pseudoconteo se calculó como el valor mínimo de la tabla de expresión génica tras la normalización. A continuación, se promediaron las réplicas y se calcularon los valores log2(FC) entre las muestras de Lam-KD y las de control.

El ensayo de RT-qPCR en tiempo real para los genes seleccionados aleatoriamente de diferentes LADs se realizó con ADNc sintetizado con cebadores oligo(dT) sobre el ARN poli(A)+ aislado de 3 réplicas biológicas de células Lam-KD o de control S2, utilizando la química EvaGreen (Jena Bioscience) y el hardware CFX96 (BioRad). Los niveles de expresión de los genes se normalizaron con respecto a la expresión del gen act5C. Para la RT-PCR semicuantitativa, aplicada para el análisis de los genes del LAD 60D, se realizó la transcripción inversa del ARN utilizando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen) en presencia de cebadores aleatorios hexámeros. La amplificación por PCR de los cDNAs se realizó con la adición de 33P-dATP. Las sondas después de la PCR se separaron en PAAG al 5%, que luego se fijó, se secó y se expuso a la pantalla de fósforo de almacenamiento (Amersham Biosciences). Las señales se escanearon con un Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Para cada par de cebadores se optimizó el número de ciclos de PCR para ajustarse a la fase exponencial de amplificación, que se controló mediante una dilución doble del ADNc. Los niveles de expresión de los genes se normalizaron con respecto a la expresión del gen ubicuo CG4589. Las secuencias de los cebadores específicos de los genes se presentan en la Tabla Suplementaria 1.

Procedimiento de ChIP-seq y análisis de datos

ChIP-seq de dos réplicas biológicas de células de control y Lam-KD S2 con anticuerpos acetilados anti-H3-pan (Active Motif, #39139) se realizó como se describió previamente56, con algunas modificaciones. Después de enjuagar con PBS, se fijaron ~2 × 107 células con formaldehído al 1,8% en PBS con 0,5 mM de DTT durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reticulación se detuvo añadiendo glicina a 225 mM durante 5 min y lavando en PBS que contenía 0,5 mM de DTT tres veces durante 5 min. Las células se lavaron una vez en el tampón A2 (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% desoxicolato sódico, 0,5 mM DTT, cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche)). Las células se lisaron en el tampón A2 que contenía un 1% de SDS durante 10 minutos a temperatura ambiente, tras lo cual el lisado se diluyó 20 veces en el tampón A2 y se incubó durante 2 minutos a 4 °C. Tras la sonicación con el VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 pulsos de 10 segundos con intervalos de 10 segundos a una potencia máxima del 15%) y la centrifugación a alta velocidad durante 10 minutos, se recuperó la cromatina fragmentada (con un tamaño medio de fragmento de ADN de ~0,5 kb) en el sobrenadante. Para cada inmunoprecipitación, se preincubaron ~10 μg de cromatina (~700 µl) en presencia de 100 μl de Proteína A-Sefarosa (PAS, 50% p/v, GE Healthcare) durante 1 h a 4 °C. El PAS se eliminó por centrifugación, se aisló el 5% de la cromatina como material de «Entrada», tras lo cual se añadieron 2 µl de anticuerpos anti-H3-pan acetilados (Active Motif, #39139) al resto de la cromatina y las muestras se incubaron durante la noche a 4 °C en una rueda giratoria. A continuación, se añadieron 100 μl de PAS y se continuó la incubación durante 4 h a 4 °C. Las muestras se centrifugaron a máxima velocidad durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Las muestras se lavaron cuatro veces en el tampón A2 que contenía 0,05% de SDS y dos veces en el tampón EDTA 1 mM, Tris 10 mM (pH 8), DTT 0,5 mM (cada lavado durante 5 min a 4 °C). La cromatina se eluyó del PAS en 100 μl de EDTA 10 mM, SDS 1%, Tris 50 mM (pH 8) a 65 °C durante 10 min, seguido de centrifugación y recuperación del sobrenadante. El material PAS se volvió a extraer en 150 μl de TE, 0,67% SDS. Para revertir los enlaces cruzados, el eluido combinado (250 μl) se incubó 6 h a 65 °C y se trató con proteinasa K durante 3 h a 50 °C. Las muestras se extrajeron con fenol-cloroformo y se precipitaron con isopropanol en presencia de 20 μg de glucógeno. El ADN se disolvió en 100 μl de agua. Las muestras de ChIP que contenían ~25 ng de ADN precipitado, así como las muestras de «entrada» se prepararon para la secuenciación de próxima generación utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para Illumina (New England Biolabs). Las bibliotecas se secuenciaron en el HiSeq 2000 de Illumina, con lo que se obtuvieron entre 3,1 y 3,4 × 106 lecturas de 75 pb. Las lecturas se asignaron al genoma de referencia de D. melanogaster (versión dm3) utilizando Bowtie 2 v2.2.1 (con la opción -muy sensible)57 . Las lecturas con baja calidad de mapeo se eliminaron utilizando SAMtools53 con la opción -q 30. Las lecturas duplicadas se eliminaron utilizando SAMtools rmdup. Calculamos el log2 de ChIP y las señales de entrada en bines genómicos de 1 kb utilizando BEDtools54 v2.16.2, y luego aplicamos la función hclust en R para agrupar las réplicas utilizando el coeficiente de correlación de 1-Spearman como métrica de distancia. Las lecturas se asignaron a LADs si se solapaban con LADs, mientras que las lecturas se asignaron a inter-LADs si estaban al menos a 1kb de distancia de LADs. Se calculó el número de lecturas dentro de cada LAD e inter-LAD, se normalizaron los valores para la suma de la cobertura de lecturas por réplica, se excluyeron las LADs con cobertura cero y las inter-LADs del análisis posterior, se promediaron las réplicas y se calcularon los valores log2(FC) entre las muestras de Lam-KD y las de ChIP de control.

Procedimiento Hi-C y análisis de datos

Las bibliotecas Hi-C de dos réplicas biológicas independientes de células S2 de control y Lam-KD se prepararon esencialmente como se ha descrito previamente36 utilizando la enzima de restricción HindIII-HF (NEB). Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma HiSeq 2000 de Illumina, lo que dio lugar a 3-4 × 107 lecturas de extremo pareado. Las lecturas se asignaron al genoma de referencia de D. melanogaster (versión dm3) utilizando Bowtie 2 v2.2.1 (con la opción -muy sensible)57. Los datos Hi-C se procesaron utilizando el pipeline ICE v0.9 (20 iteraciones de corrección iterativa) como se describe58. Se obtuvieron mapas de interacción Hi-C con una resolución de 20 kb. Los TADs se predijeron utilizando el software Armatus59 v1.0, en el que el tamaño medio y el número de TADs está determinado por el parámetro de escala γ. La anotación de los TADs se realizó en dos pasos como se describe36. En primer lugar, seleccionamos manualmente el parámetro γ para lograr una buena división de las TAD (γ = 1,20 para las células Lam-KD y γ = 1,12 para las células de control). A continuación, los TADs mayores de 600 kb se dividieron en TADs más pequeños con el parámetro de escala γ multiplicado por 2. Después, los TADs más pequeños (iguales o menores de 60 kb) se anotaron como inter-TADs debido a su estructura interna mal resuelta. Como resultado, se revelaron 576 (en el control) y 588 (en Lam-KD) TADs. Para examinar si las posiciones de los TADs se alteran con Lam-KD, analizamos el grado de solapamiento de cada TAD en las réplicas fusionadas de las células de control y Lam-KD con el de las réplicas de control o en las réplicas de Lam-KD y no encontramos diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05 en una prueba de Wilcoxon de dos caras). El ACF dentro de cada TAD se calculó como un valor medio de los números de lectura corregidos iterativamente entre todos los bins genómicos pertenecientes al TAD, excluyendo los bins de frontera de ambos lados del TAD. El ACF dentro de cada inter-TAD se calculó como un valor medio de los números de lectura corregidos iterativamente entre todos los bins genómicos pertenecientes al inter-TAD y los bins de frontera de los TADs adyacentes. Para cada TAD, se calculó la relación entre el valor de ACF en cada réplica de Lam-KD y el valor de ACF en cada réplica de control (cuatro relaciones en total). Los TADs con al menos tres ratios del mismo signo se utilizaron para el análisis posterior. Observamos que cuando seleccionamos los TADs según un criterio más estricto (es decir, los cuatro ratios se cambiaron en la misma dirección), no afectó a los resultados del análisis (Fig. 6 suplementaria). Los compartimentos de cromatina se anotaron utilizando el análisis de componentes principales como se describe17. Se generaron gráficos de silla de montar como se ha descrito58. Brevemente, utilizamos los mapas Hi-C observados/esperados, que calculamos a partir de los mapas de interacción de 20-kb corregidos iterativamente de las interacciones cis, dividiendo cada diagonal de una matriz por su valor medio en todo el cromosoma. En cada mapa observado/esperado, reordenamos las filas y las columnas en el orden de los valores crecientes de PC1 (que calculamos para las matrices de control). Por último, agregamos las filas y las columnas de la matriz resultante en 20 intervalos agregados de igual tamaño, obteniendo así un gráfico de compartimentación en forma de silla de montar.

Análisis de los datos publicados

Empleamos la anotación del tipo de cromatina para las células S240. Se calcularon las proporciones de los tipos de cromatina en intervalos de 20 kb. La anotación de los LADs se obtuvo de la ref. 28. Se calculó la proporción de la longitud de los LADs en cada bin de 20-kb TAD.

Modelación de polímeros

Se utilizó la Dinámica de Partículas Disipativas (DPD) para realizar simulaciones por ordenador, como se describió previamente36 con algunas modificaciones. Brevemente, las macromoléculas se representan en términos del modelo de cuentas y muelles, con las partículas interactuando por una fuerza conservativa (repulsión), una fuerza disipativa (fricción) y una fuerza aleatoria (generadora de calor). La descripción detallada de la aplicación de esta técnica ya se ha presentado anteriormente60. El volumen de la celda simulada era de 50 × 50 × 50 unidades DPD, la densidad es igual a 3, por lo que el número total de partículas en el sistema es de 375.000. Asumimos que una partícula corresponde a un nucleosoma. Además, introducimos condiciones de contorno especiales, que son periódicas para el disolvente e impermeables para las demás partículas. La superficie está formada por partículas inmóviles y colocadas de forma hexagonal. En nuestras simulaciones, las partículas imitan los tipos de nucleosomas «activos» o «inactivos», mientras que la superficie imita el NL. Las partículas «inactivas» pueden crear enlaces reversibles de «saturación «61,62 entre sí y con las partículas de una superficie. Cada partícula «inactiva» puede tener sólo un enlace adicional por momento, lo que simula una interacción de una cola de histona cargada positivamente de un nucleosoma no acetilado con el «parche ácido» de otro nucleosoma42,43,63. Nuestra cadena de copolímeros está representada por 64 bloques, cada uno de los cuales consta de 500 partículas «inactivas» y 50 «activas». La probabilidad de crear una asociación entre dos partículas «inactivas» se fijó en 0,001, entre la partícula «inactiva» y la superficie – 0,007, mientras que la probabilidad de romper dicha asociación se fijó en 0,01. Durante las simulaciones, todas las partículas fueron revisadas cada 200 pasos DPD, cuando se obtuvo el equilibrio local. Realizamos 10 ejecuciones independientes en el superordenador MSU «Lomonosov-2» utilizando nuestra propia implementación para el código DPD paralelizado de descomposición de dominios que está disponible en GitHub .

Análisis estadístico

Aplicamos la prueba de Wilcoxon para comprobar si la distribución de los valores de log2(FC) era simétrica en torno a cero, así como para comprobar si dos distribuciones de los valores de log2(FC) diferían por un desplazamiento de localización de cero.

Resumen del informe

Más información sobre el diseño experimental está disponible en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.