- Abstract
- 1. Introducción
- 2. Materiales y Métodos
- 2.1. Cepas de Candida albicans
- 2.2. Aceite del árbol del té (TTO)
- 2.3. Fluconazol
- 2.5. Determinación de los valores de CMI y MFC para TTO y Terpinen-4-ol
- 2.6. Breve pretratamiento de Candida albicans con TTO 1/4 MIC
- 2.7. Determinación de los valores de CIM y CMF de fluconazol tras el pretratamiento breve de Candida albicans con TTO de 1/4 de CIM
- 2.8. Pretratamiento prolongado de Candida albicans con fluconazol y dosis subletales de TTO o Terpinen-4-ol
- 2.9. Métodos estadísticos
- 3. Resultados
- 4. Discusión
- Conflicto de intereses
- Agradecimientos
Abstract
El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad del fluconazol contra 32 cepas clínicas de Candida albicans resistentes al fluconazol, y la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231, tras su exposición a concentraciones subletales de aceite del árbol del té (TTO) o de su principal componente bioactivo, el terpinen-4-ol. Para todas las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol probadas, las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) de TTO y terpinen-4-ol fueron bajas, oscilando entre el 0,06% y el 0,5%. La exposición de 24 horas de las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol con dosis subletales de TTO mejoró la actividad del fluconazol contra estas cepas. En general, el 62,5% de las cepas se clasificaron como susceptibles, el 25,0% mostraron una susceptibilidad intermedia y el 12,5% fueron resistentes. Para todas las cepas clínicas probadas, la CIM de fluconazol disminuyó de una media de 244,0 μg/mL a una media de 38,46 μg/mL, y las concentraciones fungicidas mínimas (CFM) de fluconazol disminuyeron de una media de 254,67 μg/mL a una media de 66,62 μg/mL. Se comprobó que el terpinen-4-ol era más activo que el TTO, y mejoraba fuertemente la actividad del fluconazol contra las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol. Los resultados de este estudio demuestran que la combinación de sustancias naturales, como el TTO, y de fármacos convencionales, como el fluconazol, puede ayudar a tratar infecciones por hongos difíciles.
1. Introducción
Los aceites esenciales son sustancias antisépticas producidas por las plantas. El aceite del árbol del té (TTO) es el aceite esencial obtenido por destilación al vapor de la planta nativa australiana Melaleuca alternifolia y se utiliza medicinalmente como antiséptico tópico. Tiene un amplio espectro de actividad antimicrobiana contra una amplia gama de bacterias, virus y hongos, incluidas las levaduras y los dermatofitos. El TTO es una mezcla de más de 100 compuestos diferentes, principalmente terpenos (sobre todo monoterpenos y sesquiterpenos). Las propiedades físicas y la composición química del TTO son variables, por lo que es importante determinar las normas internacionales. La norma australiana para el aceite del árbol del té (AS 2782-1985) incluye directrices relativas a los niveles de dos componentes: el contenido mínimo de terpinen-4-ol debe ser al menos del 30% y el contenido máximo de 1,8-cineol debe ser inferior al 15% del volumen del aceite . La norma internacional para el aceite del árbol del té (ISO 4730:2004) incluye valores porcentuales máximos y mínimos para los 15 componentes más importantes del TTO. El TTO obtenido por destilación al vapor de las hojas y las ramas terminales de Melaleuca alternifolia Cheel, Melaleuca linariifolia Smith, Melaleuca dissitiflora F. Mueller y otras especies de Melaleuca debe ajustarse a esta norma.
El TTO se ha utilizado durante siglos en la medicina popular australiana, predominantemente para el tratamiento de heridas . En la década de 1920, Penfold describió por primera vez las propiedades y la composición química del TTO, y posteriormente confirmó las propiedades antisépticas del TTO y sus componentes . En la década de 1930, aparecieron publicaciones consecutivas que demostraban la potente actividad antimicrobiana del TTO cuando se utilizaba en la terapia de inhalación, la cirugía aséptica, la cirugía dental, la desinfección de heridas y el enjuague de la cavidad oral.
Actualmente, el TTO se utiliza como agente local para el tratamiento de diversas enfermedades, predominantemente dermatosis (por ejemplo, herpes labial recurrente, acné, pústulas, caspa y sarpullido). El TTO también se utiliza para tratar las infecciones por Staphylococcus aureus de la cavidad oral y la faringe, la vaginitis y las enfermedades del tracto respiratorio. Numerosos estudios han confirmado la amplia actividad antimicrobiana de la TTO contra bacterias, hongos y virus, así como contra microorganismos resistentes a los medicamentos convencionales. Esto es importante debido al aumento de las infecciones difíciles de tratar, ya que el TTO puede utilizarse como alternativa o en combinación con los fármacos convencionales (incluidos los antibióticos y los agentes quimioterapéuticos).
El tratamiento de las infecciones puede basarse en la monoterapia (utilizando un fármaco antimicrobiano) o en la terapia combinada (dos o más fármacos). El objetivo principal de la terapia combinada es potenciar la acción de los fármacos a la vez que se reducen las dosis, mediante el sinergismo. Cuando la monoterapia o la terapia combinada basada en fármacos convencionales no tiene éxito, el tratamiento combinado que incluye un agente natural puede ser más eficaz. Varios estudios recientes han informado de la mayor actividad antimicrobiana de las sustancias naturales combinadas con fármacos convencionales en comparación con el tratamiento con fármacos convencionales por sí solo .
El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad del fluconazol contra cepas clínicas de Candida albicans resistentes al fluconazol y la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231, tras su exposición a concentraciones subletales de TTO o de su principal componente bioactivo terpinen-4-ol.
2. Materiales y Métodos
2.1. Cepas de Candida albicans
En este estudio se incluyeron 32 cepas clínicas de Candida albicans, que se aislaron de los siguientes materiales: hisopos de faringe y cavidad oral (), vagina (), esputo () o heces (). Estas cepas se aislaron mediante cultivo en agar Sabouraud (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Francia), y la identificación de la especie se realizó mediante la prueba bioquímica ID 32C (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Francia). También se utilizó la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231, adquirida en Oxoid Ltd. (Basingstoke, Gran Bretaña). (Basingstoke, Gran Bretaña). Previamente determinamos la sensibilidad de las cepas de C. albicans al fluconazol mediante la prueba de susceptibilidad por difusión en disco de Kirby-Bauer utilizando discos de papel de filtro de 6 mm impregnados con 10 μg de fluconazol obtenidos de DHN (Cracovia, Polonia) y agar YNB (Yeast Nitrogen Base-Difco 0,5%, glucosa 3%, agar 1,8%, pH = 7) también obtenido de DHN (Cracovia, Polonia). Las cepas de C. albicans se clasificaron como susceptibles (diámetro de la zona de inhibición del crecimiento ≥18 mm), de susceptibilidad intermedia (diámetro de la zona de inhibición del crecimiento de 14 mm a 17 mm) o de resistencia (diámetro de la zona de inhibición del crecimiento <14 mm) al fluconazol (los datos se describen en el capítulo 3). Los valores de MIC (concentración inhibitoria mínima) y MFC (concentración fungicida mínima) de fluconazol se determinaron por el método de dilución en caldo según el documento M27-A3-2008 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Utilizando esta norma, las cepas de C. albicans se clasificaron como susceptibles (CMI ≤ 8 μg/mL), susceptibles intermedias (CMI de 9 μg/mL a 63 μg/mL) o resistentes (CMI ≥ 64 μg/mL) al fluconazol (los datos se presentaron en el capítulo 3).
2.2. Aceite del árbol del té (TTO)
En este estudio, se utilizó aceite del árbol del té australiano (Melaleuca alternifolia) de Thursday Plantation (Integria Healthcare, Eight Mile Plains, QLD, Australia) serie 270930 que se ajusta a la norma ISO 4730:2004 (Tabla 1). El TTO se destiló a partir de hojas de Melaleuca alternifolia especialmente seleccionadas, una planta originaria de las regiones costeras del norte de Nueva Gales del Sur y del sureste de Queensland en Australia. El análisis de la composición del TTO se realizó por cromatografía de gases según la norma internacional ISO 4730 . Se realizó en las siguientes condiciones: columna de sílice fundida (50 m × 0,20 mm i.d., espesor de la película 0,25 μm) y se utilizó un detector del tipo de ionización de llama, el gas portador fue hidrógeno (caudal de 1 mL/min), el programa de temperatura del horno fue de 70°C a 220°C a un ritmo de 2°C/min, la temperatura del inyector fue de 230°C, la temperatura del detector fue de 250°C, el volumen de TTO inyectado fue de 0,2 μL, y la relación de división fue de 1 : 100.
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En nuestro estudio, también utilizamos terpinen-4-ol, que se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
2.3. Fluconazol
En este estudio, utilizamos el fármaco antifúngico fluconazol (Polfarmex, Kutno, Polonia). La estructura de la molécula de fluconazol se muestra en la Figura 1.
Las células de Candida albicans cultivadas durante 24 h en agar Sabouraud se suspendieron en una solución salina (0,85% de NaCl) y se ajustaron a una densidad estándar de 0,5 McFarland (1,5 × 108 UFC/mL). Esta suspensión se diluyó posteriormente hasta una densidad de 6 × 104 UFC/mL. La suspensión se utilizó entonces para estimar los valores de MIC y MFC para TTO, terpinen-4-ol y fluconazol.
2.5. Determinación de los valores de CMI y MFC para TTO y Terpinen-4-ol
La actividad de TTO frente a las cepas de C. albicans ensayadas se determinó mediante macrodilución en caldo utilizando las normas generales de dilución descritas por PN-EN ISO 20776-1:2007 . La TTO se diluyó en serie en medio Sabouraud líquido con un 10% de Tween 80 hasta alcanzar concentraciones finales de TTO del 1% al 0,0075%. El detergente Tween 80 ayuda a disolver el TTO. Se añadió el mismo volumen de la suspensión de C. albicans a cada tubo para obtener una densidad final de 3 × 103 UFC/mL. Tras 24 horas de incubación a 35°C, se evaluó visualmente el crecimiento celular en los tubos con TTO y en el tubo de control positivo (sin TTO). La CIM se definió como la concentración más baja de TTO que no condujo a un crecimiento visible de las cepas celulares probadas. El valor MFC se definió como la concentración más baja de TTO que no mostró crecimiento de las colonias de C. albicans. El experimento se realizó tres veces. Los valores MIC y MFC del terpinen-4-ol se determinaron de forma idéntica a la descrita anteriormente. Las CIM de TTO y terpinen-4-ol se utilizaron para calcular las dosis subletales de TTO y terpinen-4-ol utilizadas en los siguientes experimentos.
2.6. Breve pretratamiento de Candida albicans con TTO 1/4 MIC
Para cada muestra, se preparó un tubo que contenía solución salina con Tween 80 al 10% y TTO hasta una concentración final de TTO 1/4 MIC. También se preparó un tubo de control sin TTO. A continuación, se añadió la suspensión de C. albicans a los tubos para obtener una densidad final de 3 × 103 UFC/mL. A continuación, las suspensiones se incubaron a 35°C durante 30 minutos. A continuación, las muestras se enjuagaron dos veces y se centrifugaron entre los enjuagues (3000 ×g, 15 minutos), y las células se resuspendieron hasta alcanzar una densidad de 6 × 104 UFC/mL. La suspensión se utilizó entonces para determinar la CIM de fluconazol y la concentración fungicida mínima (CFM) de fluconazol. El estudio se realizó por triplicado.
2.7. Determinación de los valores de CIM y CMF de fluconazol tras el pretratamiento breve de Candida albicans con TTO de 1/4 de CIM
La actividad de fluconazol frente a las cepas de C. albicans ensayadas se determinó mediante macrodilución en caldo utilizando las normas generales de dilución descritas por PN-EN ISO 20776-1:2007 . Se prepararon diluciones seriadas y paralelas de fluconazol que iban de 256,0 μg/mL a 0,125 μg/mL en medio Sabouraud líquido, y se incluyó un tubo de control sin el fármaco. Para cada uno de los tubos, se añadió el mismo volumen de suspensión de células de C. albicans pretratadas con 1/4 MIC de TTO, y el inóculo se ajustó a una densidad final de 3 × 103 UFC/mL. Tras 24 horas de incubación a 35°C, se evaluó visualmente el crecimiento celular en cada tubo. El valor de la CIM se definió como la concentración más baja de fluconazol que dio lugar a un crecimiento no visible de las cepas analizadas. Las células del tubo identificado como la CIM, así como varias de las diluciones circundantes, se sembraron en agar Sabouraud. Tras 24 horas de incubación a 35°C, se contaron las colonias de C. albicans. El valor MFC se definió como la concentración más baja de fluconazol que no mostró crecimiento de las colonias de C. albicans. El experimento se realizó por triplicado. Las cepas de C. albicans se clasificaron como susceptibles, intermedias o resistentes al fluconazol según el documento M27-A3-2008 del CLSI, como se describe en la sección 2.1.
2.8. Pretratamiento prolongado de Candida albicans con fluconazol y dosis subletales de TTO o Terpinen-4-ol
Se prepararon diluciones seriadas y paralelas de fluconazol que oscilaban entre 256,0 μg/mL y 0,125 μg/mL en medio de cultivo Sabouraud líquido. Se incluyeron dos controles positivos. Todos los tubos contenían un 10% de Tween 80, y se añadió TTO a cada dilución y a uno de los tubos de control para lograr una concentración final de 1/4 de TTO MIC. El segundo tubo de control contenía sólo el medio líquido. A continuación, se añadió un volumen igual de suspensión de C. albicans a cada tubo hasta alcanzar una densidad final de 3 × 103 UFC/mL. Todos los tubos se incubaron a 35°C durante 24 h. Tras la incubación, se evaluó visualmente el crecimiento celular en cada tubo y se definieron los valores de MIC y MFC de fluconazol, como se ha descrito anteriormente. Las células del tubo identificado como MIC, así como varias de las diluciones circundantes, se sembraron en agar Sabouraud. Tras 24 horas de incubación a 35°C, se contaron las colonias de C. albicans y se definió el valor MFC de fluconazol. El experimento se realizó por triplicado. El pretratamiento prolongado de C. albicans con fluconazol y terpinen-4-ol se realizó de forma idéntica a la descrita anteriormente.
2.9. Métodos estadísticos
Los resultados se presentan como la media aritmética y la mediana. Las diferencias estadísticas entre los valores medios se determinaron mediante la prueba de Student y la prueba de Mann-Whitney, en función de la correlación de los resultados con una distribución normal. Los valores de se consideraron estadísticamente significativos. Para realizar los análisis estadísticos se utilizó el programa STATISTICA versión 10 (StatSoft, Cracovia, Polonia).
3. Resultados
Las cepas de Candida albicans ensayadas fueron resistentes al fluconazol y susceptibles a bajas concentraciones de TTO. Las cepas clínicas de C. albicans y la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231, ensayadas mediante la prueba de susceptibilidad por difusión en disco de Kirby-Bauer, no mostraron la zona de inhibición del crecimiento. Todas las cepas de C. albicans estudiadas se clasificaron como resistentes al fluconazol. Los valores de MIC de fluconazol para las 32 cepas clínicas de C. albicans oscilaron entre 64,0 μg/mL y 256,0 μg/mL (media = 244,0 ± 47,22 μg/mL). Los valores más comunes fueron 256,0 μg/mL (30 cepas) y 64,0 μg/mL (2 cepas). Para la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231 la CIM de fluconazol fue de 256,0 μg/mL.
Las CIM de TTO para las 32 cepas clínicas de C. albicans oscilaron entre el 0,06% y el 0,5% (media = 0,19 ± 0,09%). Los valores más comunes fueron 0,125% (15 cepas) y 0,25% (15 cepas). Las CIM de TTO de las dos cepas restantes fueron del 0,06% y del 0,5%. Para la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231, la CIM de TTO fue del 0,125%. Estos resultados indican que las cepas de C. albicans analizadas no mostraron ninguna resistencia cruzada a la TTO y al fluconazol. Los valores de MIC de TTO se utilizaron para calcular las dosis subletales (1/4 de MIC de TTO) utilizadas en el resto del estudio.
El breve pretratamiento de 32 cepas clínicas de C. albicans y de la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231 con 1/4 de MIC de TTO no modificó los valores de MIC y MFC de fluconazol. La exposición de las cepas de C. albicans a 1/4 MIC de TTO y fluconazol durante 24 horas (pretratamiento prolongado) aumentó significativamente la susceptibilidad de las cepas de levadura al fluconazol. De las 32 cepas clínicas de C. albicans resistentes al fluconazol, 28 cepas (87,5%) mostraron entonces una susceptibilidad alta o intermedia al fluconazol (Tabla 2).
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La exposición de cepas de C. albicans resistentes a fluconazol durante 24 h a TTO de 1/4 de MIC y fluconazol mejoró la actividad de fluconazol contra estas cepas. En general, el 62,5% de las cepas se clasificaron como susceptibles, el 25,0% mostraron una susceptibilidad intermedia y el 12,5% fueron resistentes. Para todas las cepas clínicas probadas, la CIM media de fluconazol disminuyó de 244,0 μg/mL a 38,46 μg/mL después de este pretratamiento prolongado, y la MFC media de fluconazol disminuyó de 254,67 μg/mL a 66,62 μg/mL (Tabla 3). Los valores de MIC y MFC para las cepas susceptibles () y las cepas con susceptibilidad intermedia () fueron estadísticamente bajos en comparación con los valores análogos obtenidos para la muestra de control y para las muestras que sólo fueron pretratadas brevemente con TTO. Para el grupo de cepas susceptibles, la CIM de fluconazol disminuyó a una media de 0,52 μg/mL, y la MFC de fluconazol disminuyó a una media de 4,25 μg/mL. El pretratamiento prolongado de la cepa estándar de Candida albicans ATCC 10231 con TTO de 1/4 de MIC y fluconazol no aumentó la susceptibilidad de esta cepa al fluconazol, como las cuatro cepas clínicas de C. albicans resistentes al fluconazol estudiadas.
| (a) Valores de MIC de fluconazol (μg/mL) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| (b) Valores MFC de fluconazol (μg/mL) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Todas las 32 cepas clínicas de Candida albicans resistentes al fluconazol probadas. bCepas clínicas de Candida albicans resistentes al fluconazol ( = 20) que mostraron susceptibilidad al fluconazol tras un pretratamiento prolongado con TTO. cCepas clínicas de Candida albicans resistentes al fluconazol ( = 8) que mostraron una susceptibilidad intermedia al fluconazol tras un pretratamiento prolongado con TTO. : nivel de significación estadística para los valores medios de MIC/MFC. : significación estadística en comparación con el control. : significación estadística en comparación con el grupo que fue pretratado brevemente. |
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El terpinen-4-ol, el principal componente bioactivo presente en el TTO, potenció fuertemente la actividad del fluconazol contra las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol. Las CMI de terpinen-4-ol para las cepas clínicas de C. albicans oscilaron entre el 0,06% y el 0,25% (media = 0,11 ± 0,09%). Para la cepa estándar de C. albicans ATCC 10231, la CIM del terpinen-4-ol fue del 0,06%. Las cepas de C. albicans analizadas no mostraron ninguna resistencia cruzada al terpinen-4-ol y al fluconazol. La exposición de cepas clínicas y estándar de C. albicans resistentes al fluconazol durante 24 horas al fluconazol y a dosis subletales (1/4 de la CIM) de terpinen-4-ol mejoró fuertemente la actividad del fluconazol contra estas cepas, y todos los aislados de C. albicans se clasificaron como susceptibles (la CIM del fluconazol disminuyó a 0,125 μg/mL). Resumimos los resultados de este estudio, y los datos más importantes se presentan en forma de tabla (Tabla 4).
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4. Discusión
TTO es el aceite esencial más utilizado por sus propiedades antibacterianas y antifúngicas . En este estudio, se evaluó el cambio en la actividad del fluconazol in vitro frente a cepas clínicas de Candida albicans resistentes al fluconazol expuestas a las concentraciones subletales de TTO o de terpinen-4-ol, el principal componente bioactivo de TTO. Los estudios in vitro anteriores sobre la sensibilidad de Candida spp. a TTO han demostrado que TTO es muy activo frente a estos microbios, así como a las cepas resistentes a los azoles, para las que las CIM de TTO oscilaron entre el 0,25% y el 0,5% . Para las cepas de C. albicans que eran resistentes tanto al fluconazol como al itraconazol, las CIM de la TTO oscilaban entre el 0,25 y el 1,0%, la CIM50 de la TTO era del 0,5% y la CIM90 de la TTO era del 1%. Otro estudio demostró que tres cepas clínicas de C. albicans resistentes al fluconazol tenían MICs de TTO muy bajas (0,15% para dos cepas y 0,07% para la tercera cepa).
Los experimentos realizados en este estudio confirman los resultados de los estudios publicados anteriormente en el sentido de que todas las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol probadas eran sensibles a la TTO . Las CIM de TTO determinadas fueron bajas, oscilando entre el 0,06% y el 0,5%. La actividad antimicrobiana de TTO se atribuye principalmente al terpinen-4-ol, el principal componente bioactivo presente en TTO . Los valores de MIC determinados para el terpinen-4-ol fueron muy bajos, oscilando entre el 0,06% y el 0,25%. Nuestro estudio y otros estudios muestran que C. albicans no presenta resistencia cruzada a la TTO y a los agentes azólicos . No se ha notificado resistencia clínica a la TTO. La naturaleza multicomponente de la TTO puede reducir la posibilidad de que se produzcan resistencias de forma espontánea, y pueden ser necesarias múltiples mutaciones simultáneas para superar todas las acciones antimicrobianas de cada uno de los componentes . Así, el TTO puede utilizarse como antiséptico tópico para tratar eficazmente las micosis superficiales causadas por Candida spp. resistentes al fluconazol y otras levaduras resistentes a los azoles. Lamentablemente, la TTO puede ser potencialmente tóxica cuando se ingiere en dosis elevadas y, por tanto, no debe administrarse por vía oral. La toxicidad oral aguda de la TTO es similar a la toxicidad oral de otros aceites esenciales comunes, por ejemplo, como el aceite de eucalipto. La naturaleza lipofílica del TTO, que le permite penetrar en las capas externas de la piel, potencia no sólo las acciones antisépticas sino también la posibilidad de toxicidad del TTO debido a la absorción dérmica. El TTO puede causar irritación de la piel a concentraciones más altas y puede provocar reacciones alérgicas en individuos predispuestos . Zhang y Robertson observaron el efecto ototóxico del 100% de TTO . La toxicidad de la TTO depende de la dosis, y la mayoría de los efectos adversos pueden evitarse mediante el uso de la TTO en forma diluida. El TTO no es mutagénico ni genotóxico.
Hay un creciente interés no sólo en la actividad de las sustancias naturales contra los microbios resistentes, sino también en las interacciones sinérgicas entre estas sustancias y los fármacos convencionales. El fluconazol es uno de los agentes antifúngicos azólicos ampliamente utilizados tanto para la profilaxis como para la terapia de las infecciones por Candida . En este estudio, exploramos los cambios en la actividad del fluconazol contra las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol tras la exposición a concentraciones subletales de TTO o terpinen-4-ol. Utilizamos exclusivamente cepas resistentes al fluconazol porque la identificación de tratamientos sinérgicos para estas cepas sería especialmente importante. Probamos concentraciones subletales de TTO y terpinen-4-ol porque esperábamos que concentraciones inferiores a la CMI debilitaran la estructura celular sin matar las células, facilitando la actividad del fluconazol y, en consecuencia, inhibiendo la resistencia de C. albicans al fluconazol. Nuestros resultados muestran que la exposición breve (0,5 h) de las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol a una concentración subletal de TTO (1/4 de TTO MIC) no influyó en la actividad antifúngica del fluconazol. Sin embargo, la exposición de las células de C. albicans a una concentración subletal de TTO y su posterior tratamiento con fluconazol inhibió la resistencia al fluconazol en el 87,5% de las cepas analizadas. Estos resultados sugieren que existe una interacción sinérgica entre el fluconazol y la TTO contra la C. albicans resistente al fluconazol. El TTO se utilizó para permeabilizar las membranas celulares de la levadura, aumentando notablemente la susceptibilidad al fluconazol. El TTO se incrusta en la membrana de la bicapa lipídica, lo que altera su estructura, dando lugar a un aumento de la permeabilidad y a un deterioro de la función fisiológica. El TTO también inhibe la formación de tubos germinales o la conversión micelial en C. albicans e inhibe la respiración en C. albicans de forma dependiente de la dosis. Las células fúngicas expuestas a TTO acaban por romperse. Las concentraciones sutiles de TTO también debilitan la vitalidad de las células de Candida spp. El mecanismo de la actividad antifúngica del fluconazol es diferente. Se ha demostrado que el fluconazol interfiere con la enzima dependiente del citocromo P-450 C-14α-demetilasa, responsable de la producción de ergosterol. La interrupción de la síntesis de ergosterol provoca cambios estructurales y funcionales en la membrana celular del hongo, lo que predispone a las células del hongo a sufrir daños. La inhibición de las enzimas oxidativas y peroxidativas del citocromo es una actividad antifúngica adicional del fluconazol. Se han descrito varios mecanismos de resistencia al fluconazol en los aislados de C. albicans: aumento de la producción de lanosterol 14α-desmetilasa codificada por el gen ERG11 y disminución de la afinidad del lanosterol 14α-desmetilasa por el fluconazol debido a mutaciones en el gen ERG11 y un defecto en la Δ5-6 desaturasa codificada por el gen ERG3 que provoca la pérdida de función en la vía del ergosterol. El otro mecanismo de resistencia al fluconazol en C. albicans es el transporte activo de los fármacos a través de la membrana plasmática mediante «bombas de eflujo», que requiere la expresión de los genes CDR1/2 y MDR1 . El daño de la membrana celular inducido por la TTO puede interrumpir la función de las «bombas de eflujo», haciendo así que la célula fúngica sea más susceptible al fluconazol.
Nuestros datos muestran que existe un efecto sinérgico in vitro de concentraciones subletales de TTO y fluconazol contra las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol. Sin embargo, la cepa estándar de C. albicans ATCC 10231 resistente al fluconazol y cuatro cepas clínicas de C. albicans no aumentaron la susceptibilidad al fluconazol. Las diferencias en los mecanismos de resistencia de estas cepas al fluconazol fueron la causa probable de este efecto. En nuestro estudio in vitro, el componente principal del TTO, el terpinen-4-ol, fue más activo que el TTO y potenció fuertemente la actividad del fluconazol contra todas las cepas de C. albicans resistentes al fluconazol estudiadas. Mondello et al. así como Ninomiya et al. observaron que, in vivo, el TTO y el terpinen-4-ol eran igualmente eficaces contra la candidiasis causada por C. albicans resistente a los azoles. Los mecanismos subyacentes a la sinergia entre el fluconazol y el TTO no se dilucidaron. Yu et al. confirmaron el sinergismo entre el fluconazol y el triclosán contra los aislados clínicos de C. albicans resistentes al fluconazol. Liu et al. observaron un efecto sinérgico entre fluconazol y glabridina contra C. albicans relacionado con el efecto de la glabridina sobre la envoltura celular. Ahmad et al. describieron la actividad sinérgica del timol y el carvacrol con el fluconazol contra las cepas de Candida. Ambos monoterpenos inhibieron el eflujo en un 70-90%, mostrando su gran potencia para bloquear las bombas transportadoras de fármacos.
Estudios anteriores también han evaluado la actividad del TTO contra diversos microorganismos en combinación con otras sustancias antimicrobianas. Se observó un efecto sinérgico de itraconazol y TTO en un gel termosensible utilizado para tratar la candidiasis vaginal . También se han observado efectos sinérgicos entre los aceites esenciales y la ciprofloxacina, la gentamicina, la cefixima y la pristinamicina. En una prueba de difusión en disco con C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii y C. parapsilosis, se produjeron zonas de inhibición del crecimiento más grandes alrededor de los discos impregnados con TTO y anfotericina B que alrededor de los discos que sólo contenían TTO . En un estudio sobre Staphylococcus aureus, se produjeron mayores zonas de inhibición del crecimiento alrededor de los discos impregnados con TTO y otros aceites esenciales en comparación con los discos impregnados sólo con TTO.
La acción sinérgica de las sustancias antimicrobianas también se ha demostrado utilizando curvas de tiempo de eliminación. El breve pretratamiento de Pseudomonas aeruginosa con una sustancia que interrumpe la membrana citoplasmática (cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona, napéptido de polimixina B o ácido etilendiaminotetraacético) potenció la actividad bactericida del TTO, como demuestra el aumento de la velocidad de eliminación de los microbios en las curvas de tiempo de eliminación . Sin embargo, en un estudio en el que se utilizó el método E-test, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus y estafilococos coagulasa-negativos (CoNS) expuestos a concentraciones subletales de TTO durante 72 horas mostraron una mayor resistencia a la gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina, eritromicina, trimetoprima, ampicilina, ácido fusídico, mupirocina, linezolid y vancomicina. Se observó una mayor actividad antimicrobiana cuando los aceites esenciales se combinaron con sus componentes aislados (por ejemplo, terpinen-4-ol de Melaleuca alternifolia) y cuando el TTO se combinó con iones de plata.
El índice de concentración de inhibición fraccional (FIC), también denominado FICI, se utiliza para determinar si dos sustancias son sinérgicas o antagónicas. Los valores de FIC pueden interpretarse de forma diferente, sin embargo, en general, un índice FIC inferior a 0,5 indica sinergismo y un índice FIC superior a 4 indica antagonismo . El valor del índice FIC para TTO y tobramicina fue de 0,37 para Escherichia coli y de 0,62 para Staphylococcus aureus, lo que indica que estas dos sustancias son sinérgicas . Se observó un efecto sinérgico menor al tratar Candida albicans con TTO y anfotericina B y Klebsiella pneumoniae con TTO y ciprofloxacina. La TTO y la ciprofloxacina presentan efectos antagónicos contra el Staphylococcus aureus . No existe ningún efecto sinérgico entre la TTO y la lisostafina, la mupirocina, la gentamicina o la vancomicina contra las cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina. De hecho, el índice FIC indicó que la TTO y la vancomicina son antagónicas.
Los resultados de este estudio y de otros anteriores demuestran que la combinación de sustancias naturales como la TTO y fármacos convencionales como el fluconazol puede ayudar a tratar las infecciones por hongos difíciles. Sin embargo, se necesitan estudios in vitro adicionales para identificar la actividad antimicrobiana de las sustancias medicinales naturales y detectar las interacciones sinérgicas con los agentes antimicrobianos utilizados habitualmente.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.
Agradecimientos
Los autores desean dar las gracias a la empresa MELALEUCA de Gliwice (Polonia) por su amable donación del aceite de árbol de té australiano obtenido de Melaleuca alternifolia, a la empresa Polfarmex de Kutno (Polonia) por su amable donación del fluconazol, y al Laboratorio Microbiológico LABOMED de Gliwice (Polonia) por su amable donación de las cepas clínicas de Candida albicans utilizadas en este estudio.