Las cepas bacterianas y las condiciones de crecimiento

Las cepas bacterianas se enumeran en la tabla suplementaria 2. Escherichia coli se cultivó en placas de caldo Luria (LB) o en medio LB líquido, suplementado con 200 µg ml-1 de eritromicina a 37 °C. La transformación de E. coli con ADN plasmídico se llevó a cabo utilizando células químicamente competentes. S. pneumoniae serotipo 2 D39 y serotipo 4 TIGR4 y sus mutantes isogénicos se cultivaron en placas de agar sangre Columbia (Oxoid) que contenían eritromicina (5 µg ml-1) y/o cloranfenicol (5 µg ml-1), o se cultivaron en caldo Todd-Hewitt suplementado con 0,5% de extracto de levadura (THY; Roth) o medio químicamente definido (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences), respectivamente. El cultivo de neumococos en agar sangre o en cultivos líquidos se realizó a 37 °C y 5% de CO2 sin agitación.

Construcción de mutantes

Para la construcción de los mutantes tacL neumocócicos en D39 y TIGR4, se utilizó un fragmento de ADN formado por el gen S. pneumoniae D39 spd_1672 y sus regiones flanqueantes ascendentes y descendentes se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico utilizando los cebadores SPD1672_OLup_for y SPD1672_OLdwn_rev (los cebadores se enumeran en la tabla suplementaria 2). Los productos de PCR purificados se clonaron en pUC18 y se transformaron células E. coli DH5α químicamente competentes con el plásmido resultante. El plásmido recombinante pNH1 que albergaba el inserto de ADN deseado se purificó y se utilizó como plantilla para una reacción de PCR inversa con los cebadores InvrevKpnISPD1672 e InvforPstISPD1672. La secuencia génica eliminada se sustituyó por un gen ermB, amplificado por PCR a partir del vector pTP1 utilizando los cebadores InvrevKpnIErm e InforPstIErm. El plásmido recombinante final se utilizó para transformar y mutagenizar neumococos. Se evaluó la eficacia de la transformación utilizando el plásmido recombinante final frente a otro plásmido de deleción del gen (para la deleción del gen cbpL) en S. pneumoniae D39Δcps 44. Sorprendentemente, la eficiencia de transformación aumentó significativamente para la deleción de tacL (2,8 colonias por ng de plásmido para cbpL frente a 29,8 colonias por ng de plásmido para tacL).

Los mutantes isogénicos se complementaron con un sistema in trans basado en pBAV1CpE; pBAV1CpE se modificó a partir de pBAV1K-T5-gfp45, intercambiando el gen de resistencia a la kanamicina por un gen de resistencia al cloranfenicol y el promotor T5 por una región promotora de eritromicina (pE), que incluye el sitio de unión ribosomal y el codón de inicio. El gen spd_1672 completo se amplificó por PCR utilizando el cebador 1672_com_for y Spd1672_com_rev y el fragmento purificado se clonó en pBAV1CpE. El plásmido resultante pBAV-tacL se utilizó para transformar mutantes isogénicos de tacL. La deleción de tacL, así como la complementación in trans, se verificaron mediante qRT-PCR (Fig. 3 suplementaria).

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

La cepa de tipo salvaje D39 encapsulada y no encapsulada, el mutante deficiente en tacL y el mutante complementado se cultivaron en THY hasta la mitad de la fase logarítmica (A 600 = 0,35-0,45) y se cosecharon para el aislamiento de ARN utilizando el kit de purificación de ARN universal EURx GeneMatrix (roboklon). La calidad del ARN se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa y PCR estándar utilizando los cebadores EnoRT_F y EnoRT_R (véase la tabla suplementaria 2). La síntesis del ADNc se realizó utilizando la transcriptasa inversa SuperScript III (ThermoFisher) y cebadores hexaméricos_random (GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante. La calidad del ADNc se controló mediante PCR utilizando los cebadores EnoRT_F y EnoRT_R, y la concentración se midió mediante nanodrop. El ADNc se almacenó a -20 °C hasta los ensayos posteriores. Para los experimentos de qRT-PCR, se utilizó el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlusTM (Applied Biosystems) y la mezcla maestra SYBR® Green (Biorad) en combinación con cebadores específicos de tacL, así como cebadores de enolasa como control (véase la tabla suplementaria 2). Se utilizó el software StepOne (v. 2.3, Life Technologies) para el análisis de los datos. Los resultados finales se presentan como magnitud de fluorescencia (ΔRn) trazada frente a los números de ciclo de la PCR.

Secuenciación y análisis bioinformático

Secuenciación: 1 ng de ADN cromosómico purificado de S. pneumoniae D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603) y TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) se utilizó para preparar bibliotecas individuales empleando y siguiendo el kit de preparación de bibliotecas de ADN Illumina Nextera© XT. Un bioanalizador Agilent Technology 2100 sirvió para verificar la marcación y la distribución final del tamaño de los fragmentos de la biblioteca en un chip de ADN de alta sensibilidad. Se utilizaron perlas AMPure XP para la purificación de la biblioteca de ADN. La biblioteca final agrupada se aplicó a un kit MiSeq Reagent v3 de 600 ciclos y se secuenció en un sistema MiSeq como ejecución de 300 ciclos de extremo emparejado. El conjunto final de bibliotecas se enriqueció con una biblioteca de control PhiX al 5%. Se alcanzó una densidad de clusters de 847 ± 25 (K mm-2) con un 96,46 ± 1,48% de clusters que pasaron las especificaciones del filtro. 20,3 millones de lecturas (94,7%) de los 21,1 millones de lecturas totales pasaron las especificaciones del filtro, lo que dio lugar a 12,52 Gbp de datos de secuencia. Las lecturas de índice se distribuyeron uniformemente entre las seis muestras individuales. Los archivos FASTQ generados se sometieron a otros análisis bioinformáticos, como se indica a continuación.

Detección y anotación de SNP: La detección de SNP se realizó para S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL individualmente utilizando «snippy» (https://github.com/tseemann/snippy; parámetro: porción mínima para la evidencia de variantes: 60%; cobertura mínima del sitio de la variante: ≥5 secuencias leídas). Como genoma de referencia se utilizó Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) o Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

Los SNPs resultantes para cada grupo de mutantes (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) y (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) se fusionaron y compararon. La cobertura del genoma se estimó con qualimap46 utilizando los mismos genomas de referencia que para la detección de SNP.

Aislamiento de ácidos teicoicos neumocócicos

Extracción y aislamiento de LTA: La purificación de LTA se realizó básicamente como se describe en otro lugar7, pero para optimizar el rendimiento de pnLTA, se ha modificado un detalle específico. Las células neumocócicas se resuspendieron en tampón citrato (50 mM, pH 4,7) y se disolvieron tres veces mediante prensa francesa (Constant Cell Disruption System, Serial No. 1020) a 10 °C a una presión de 20 kPSI. Se añadió SDS a una concentración final del 4% a los sobrenadantes combinados. La solución se incubó durante 30 minutos a 100 °C y se agitó después durante toda la noche a temperatura ambiente. La solución se centrifugó a 30.000×g durante 15 minutos a 4 °C. El pellet se lavó cuatro veces con tampón de citrato utilizando las condiciones de centrifugación anteriores. Los sobrenadantes combinados que contenían LTA y el sedimento resultante, que contenía el complejo PGN-WTA en bruto, se liofilizaron por separado. Los sólidos resultantes se lavaron cinco veces con etanol (centrifugación: 20 minutos, 20 °C, 10.650×g) para eliminar el SDS y se liofilizaron (dando lugar al pellet A que contiene LTA y al pellet B que contiene el complejo PGN-WTA). Para el aislamiento de la LTA, el pellet A se resuspendió en tampón citrato y se extrajo con un volumen igual de butan-1-ol (Merck) a temperatura ambiente bajo agitación vigorosa. Las fases se separaron por centrifugación a 2.100×g durante 15 minutos a 4 °C. Se recogió la fase acuosa (que contenía LTA) y se repitió el procedimiento de extracción dos veces con la fase orgánica más la interfase. Las fases acuosas combinadas se liofilizaron y posteriormente se dializaron durante 5 días a 4 °C con un tampón de acetato de amonio 50 mM (pH 4,7; membrana de corte de 3,5 kDa); el tampón se cambió cada 24 h. La LTA cruda resultante se purificó aún más mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) realizada en una columna HiPrep Octyl-Sepharose (GE Healthcare; 16 × 100 mm, volumen de lecho 20 ml). El material crudo de LTA se disolvió en la menor cantidad posible de tampón de partida (15% de propan-1-ol (Roth) en acetato de amonio 0,1 M (pH 4,7)) y se centrifugó a 13.000×g durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante resultante se liofilizó. El pellet que contenía LTA se disolvió en el tampón de inicio de HIC a una concentración de 30 mg ml-1 y se purificó mediante HIC utilizando un gradiente lineal del 15 al 60% de propan-1-ol (Roth) en acetato de amonio 0,1 M (pH 4,7). Las fracciones que contenían LTA se identificaron mediante una prueba fotométrica de fosfato47. Las fracciones que contenían fosfato se combinaron, se liofilizaron y se lavaron con agua tras la liofilización para eliminar el tampón residual.

Extracción y aislamiento de la WTA: El aislamiento y la extracción de la WTA se llevaron a cabo como se describe en otro lugar11, pero con pequeñas modificaciones. El pellet B (que contiene el complejo PGN-WTA crudo), que surgió durante el aislamiento de la WTA, se resuspendió a una concentración de 10 mg ml-1 en Tris-HCl 100 mM (pH 7,5) que contenía 20 mM de MgSO4. Se añadieron DNasa A y RNasa I a concentraciones finales de 10 y 50 µg ml-1, respectivamente. La suspensión se agitó durante 2 horas a 37 °C. Posteriormente, se añadieron 10 mM de CaCl2 y tripsina (100 µg ml-1) y se continuó la agitación durante toda la noche a 37 °C. Se añadió SDS a una concentración final del 1% y la mezcla se incubó durante 15 minutos a 80 °C para inactivar las enzimas. La pared celular se recuperó por centrifugación durante 45 minutos a 130.000×g a 25 °C. El pellet resultante se resuspendió en 0,8 ml de LiCl 8 M por 1 ml de solución Tris-HCl utilizada inicialmente y se incubó durante 15 min a 37 °C. Después de otra centrifugación en las mismas condiciones anteriores, el pellet se resuspendió en 1 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, pH 7,0) 10 mM por ml de la solución de Tris-HCl utilizada inicialmente y esta muestra se incubó a 37 °C durante 15 min. El pellet se lavó dos veces con agua. Finalmente, el pellet se resuspendió en 2-4 ml de agua y se liofilizó, obteniéndose el complejo PGN-WTA purificado. Dependiendo de la pregunta de investigación específica, se realizaron posteriormente otros tratamientos químicos o enzimáticos.

Tratamientos químicos y enzimáticos

Tratamiento con hidracina de la LTA: La LTA purificada se disolvió a una concentración de 5 µg µl-1 en hidracina anhidra (N2H4; ICN Biomedicals) antes de incubarla durante 1 h a 37 °C mientras se agitaba. La reacción se apagó añadiendo el mismo volumen de acetona y se secó bajo una corriente de nitrógeno; el paso de secado se repitió dos veces. Posteriormente, la LTA de-O-acilada cruda se purificó mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) en un Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; tamaño de la columna: 1,5 × 120 cm; tampón: 150 mM de acetato de amonio (pH 4,7)).

Digestión enzimática del complejo PGN-WTA: Para eliminar todos los aminoácidos del PGN, el complejo PGN-WTA se disolvió en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) y se trató con la amidasa LytA neumocócica como se describe en otro lugar11. La LytA amidasa recombinante marcada con His (10 µg de LytA por mg) se añadió en tres alícuotas después de 0, 24 y 48 h para un periodo total de incubación de 72 h a 37 °C. Posteriormente, se inactivó la enzima hirviéndola durante 5 minutos a 100 °C. Tras la centrifugación (25.000×g, 15 min, 20 °C), se recogió el sobrenadante y se liofilizó. El complejo PGN-WTA crudo tratado con LytA se purificó aún más mediante GPC en un Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; tamaño de columna: 1,5 × 120 cm; tampón: 150 mM de acetato de amonio (pH 4,7)). El material de alto peso molecular obtenido (~12 mg) se digirió además con lisozima (200 µg; Sigma) y mutanolisina (200 µg; Sigma) en una mezcla de reacción de 800 µl que contenía fosfato sódico (20 mM; pH 4,8) y azida sódica (0,02%) a 37 °C durante la noche. Las enzimas se inactivaron por calentamiento a 100 °C durante 5 minutos. El material soluble se recuperó por centrifugación (18.000×g, 10 min, 20 °C) y se liofilizó. El aislamiento de la pnWTA unida a pequeños fragmentos de PGN se logró mediante una GPC final utilizando las condiciones mencionadas anteriormente.

Espectroscopia de RMN

Las mediciones espectroscópicas de RMN se realizaron en D2O a 300 K en un Bruker AvanceIII de 700 MHz (equipado con una criosonda de resonancia cuádruple inversa de 5 mm en Z). Los disolventes deuterados se compraron a Deutero GmbH (Kastellaun, Alemania). Se utilizó acetona como patrón externo para calibrar los espectros de RMN de 1H (δH 2,225) y 13C (δC 30,89). Los espectros de RMN de 31P (δP 0,0) se calibraron con ácido fosfórico al 85% en D2O como patrón externo. Las asignaciones de RMN de 1H se confirmaron mediante experimentos bidimensionales de 1H, 1H COSY y TOCSY, y las asignaciones de RMN de 13C se indicaron mediante 1H bidimensional, 13C HSQC, basándose en las asignaciones de RMN de 1H. La conectividad interresidual y otras pruebas para la asignación de 13C se obtuvieron a partir de experimentos bidimensionales de 1H, 13C HMBC y 1H, 13C HSQC-TOCSY. La conectividad del grupo fosfato se asignó mediante HMQC bidimensional de 1H, 31P y HMQC-TOCSY de 1H, 31P. Todos los datos fueron adquiridos y procesados utilizando Bruker TOPSIN V 3.0 o superior.

Espectrometría de masas

Para analizar la pnWTA unida a pequeños fragmentos de PGN, se llevó a cabo la espectrometría de masas de resonancia de ciclotrón iónico por ionización de electrospray con transformación de fourier (ESI-FT-ICR-MS) en un instrumento APEX Qe de 7 Tesla (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) utilizando el modo de iones negativos y una mezcla de agua/propan-2-ol/7 M de trietilamina/ácido acético (50:50:0.06:0,02 v/v/v) como disolvente, tal y como se ha descrito anteriormente6. El análisis por MS de la LTA tratada con hidracina se realizó en un Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Alemania) en modo de iones negativos utilizando el mismo disolvente. Se utilizó una fuente de iones Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, EE.UU.) con un voltaje de pulverización ajustado a -1,1 kV. La escala de masas se calibró externamente con glicolípidos de estructura conocida, y todos los espectros se deconvolucionaron por carga. Los números de masa indicados se refieren a la masa monoisotópica de las moléculas neutras.

Microscopía electrónica

Microscopía electrónica de barrido de emisión de campo: las bacterias se fijaron en el medio de crecimiento con formaldehído al 5% y glutaraldehído al 2,5% durante 1 h en hielo y se lavaron con tampón HEPES (HEPES 0,1 M, sacarosa 0,09 M, CaCl2 10 mM, MgCl2 10 mM, pH 6,9). Se colocó una alícuota de 50 µl de la solución bacteriana fijada en cubreobjetos recubiertos de poli-l-lisina y se dejó reposar durante 10 minutos. Tras la fijación con glutaraldehído al 2% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente, los cubreobjetos se lavaron con tampón TE (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) antes de deshidratarlos en una serie graduada de acetona (10, 30, 50, 70, 90 y 100%) en hielo durante 10 minutos para cada paso. Las muestras en el paso de acetona al 100% se dejaron alcanzar la temperatura ambiente antes de otro cambio en acetona al 100% antes del secado en punto crítico con CO2 líquido (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). Las muestras secadas se cubrieron con una película de paladio-oro mediante recubrimiento por pulverización catódica (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) antes de examinarlas en un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Zeiss Merlin (Oberkochen, Alemania) utilizando el detector HESE2 Everhart Thornley SE y el detector in-lens SE en una proporción de 25:75 a una tensión de aceleración de 5 kV.

Microscopía electrónica de transmisión: las bacterias se fijaron como en el caso anterior y se fijaron además con tetróxido de osmio (1% en tampón HEPES) durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el lavado con tampón HEPES, las muestras se deshidrataron con acetona al 10, 30 y 50% en hielo antes de incubarlas en acetona al 70% con acetato de uranilo al 2% durante una noche a 7 °C. Las muestras se deshidrataron de nuevo con acetona al 90 y al 100% en hielo, se dejaron alcanzar la temperatura ambiente y se volvieron a deshidratar con acetona al 100%, para luego pasarlas a etanol al 100%. Posteriormente, las muestras se infiltraron con la resina acrílica aromática LRWhite. Tras la polimerización durante 2 días a 50 °C, se cortaron secciones ultrafinas con un cuchillo de diamante, se recogieron en rejillas de malla de 3000 recubiertas de butvar y se contrateñaron con acetato de uranilo acuoso al 4% durante 3 minutos. Las muestras se visualizaron en un TEM 910 de Zeiss a un voltaje de aceleración de 80 kV y con aumentos calibrados.

El contraste y el brillo se ajustaron con Adobe Photoshop CS3.

Generación de anticuerpos

Los anticuerpos policlonales contra los CBP analizados se criaron en ratones utilizando protocolos de inmunización rutinarios. Brevemente, los ratones CD-1 fueron inmunizados por vía intraperitoneal con 20 µg de proteína recombinante y adyuvante incompleto de Freund (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) (50:50 v/v). En los días 14 y 28, los ratones fueron reforzados con 20 µg de proteína y adyuvante incompleto de Freund (50:50 v/v). Los ratones fueron sangrados en el día 42 y se purificaron las IgG policlonales del suero utilizando proteína A-Sefarosa (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania). Los anticuerpos se enumeran en la Tabla Suplementaria 2.

Citometría de flujo

S. pneumoniae D39 de tipo salvaje, su mutante isogénico tacL y el mutante complementado se cultivaron en medio THY hasta la mitad de la fase logarítmica, se cosecharon a 3.275×g durante 6 minutos y se lavaron con PBS (pH 7,4). Para la cuantificación del contenido de la cápsula, se incubó una suspensión de 100 µl que contenía 4 × 108 bacterias con antisacáridos anticapsulares (suero tipo 2 de SSI, Statens Serum Institute) (1:500 en PBS) durante 30-45 min a 37 °C y 5% de CO2 en placas de 96 pocillos (fondo en U, Greiner Bio-One). Tras el lavado, las muestras se incubaron con un anticuerpo secundario anti-conejo IgG acoplado a Alexa488 (Invitrogen) (1:500 en PBS, 30-45 min, 37 °C). Tras el lavado con PBS, las bacterias se fijaron con formaldehído al 1% durante la noche a 4 °C.

La abundancia de PFCs así como la cantidad de ácidos teicoicos en las cepas no encapsuladas D39 de tipo salvaje, mutante y complementada se midieron por citometría de flujo tras la fijación con formaldehído al 1% durante 1 h a 4 °C. Se incubaron 200 µl de suspensiones que contenían 8 × 108 bacterias con anticuerpos policlonales específicos contra diferentes PFC (1:500 en PBS), o para la cuantificación de los AT con anticuerpos contra P-Cho (TEPC-15) o el antígeno de Forssman (15 min a 37 °C y 5% de CO2) en placas de 96 pocillos (fondo en U, Greiner Bio-One). Tras el lavado, las muestras se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG de cabra etiquetado con Alexa488 (Invitrogen) (15 min, 37 °C). La fluorescencia se determinó utilizando un FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Análisis de inmunoblot

S. pneumoniae D39, su mutante isogénico tacL y el mutante complementado se cultivaron en medio THY hasta alcanzar un A 600 de 0,35-0,45, se cosecharon por centrifugación a 3270×g a 4 °C durante 6 min y se resuspendieron en 1 ml de tampón PBS a pH 7,4. Se cargó un total de 2 × 108 células por pocillo y se realizó una prueba de SDS-PAGE al 12% antes de transferirlas a una membrana de nitrocelulosa por semidisolución. Las membranas se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con leche desnatada al 5% (Roth) y solución salina tamponada con Tris (TBS; pH 7,4) y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos policlonales de ratón contra diferentes PFC (1:500 en leche desnatada al 5% + TBS al 0,01% de Tween (T-TBS)). Se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo contra la enolasa (1:25.000 en leche desnatada al 5% + T-TBS) como control de carga. Las membranas se lavaron con T-TBS y los PFC se detectaron con el secundario marcado con fluorescencia IRDye® 800CW. La IgG de cabra α-ratón y la enolasa se detectaron con el IRDye® 680RD marcado con fluorescencia. El anticuerpo IgG de cabra α-conejo se detectó mediante la incubación con el anticuerpo apropiado (1:15.000 en leche desnatada al 5% en T-TBS) durante 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente; las membranas se lavaron con T-TBS y finalmente una vez con TBS. El escaneo de las membranas se realizó con un escáner Odyssey® CLx (LI-COR).

Asunto de autolisis inducido por Triton X-100

Las cepas de S. pneumoniae D39 de tipo salvaje, mutante y complementada se cultivaron en medio THY hasta la mitad de la fase logarítmica, se cosecharon a 3275×g durante 6 min y se lavaron con PBS (pH 7,4). Se incubó una suspensión de 1 ml que contenía 1 × 109 bacterias con una concentración final de 0,01% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) y se incubó a 37 °C. La lisis de las células bacterianas se monitorizó midiendo la absorbancia a 600 nm en puntos de tiempo predefinidos.

Ensayo de adherencia epitelial

La adherencia neumocócica a las células epiteliales se analizó con células humanas A549 (ATCC® CCl-185TM) como se describe48. Brevemente, se inocularon células epiteliales confluentes, cultivadas en cubreobjetos de vidrio (Hartenstein; en placas de 24 pocillos, ~1 × 105 células por pocillo) con 5 × 106 neumococos de crecimiento medio exponencial y se incubaron en medio de infección (DMEM (HyClone™) + 1% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS)) a 37 °C y 5% de CO2. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato que contenía un 1% de FBS (Gibco) para eliminar las bacterias no unidas. Después, las bacterias se fijaron con PBS que contenía 1% de paraformaldehído (PFA, Roth).

Microscopía de inmunofluorescencia

Los neumococos fijados, unidos a las células A549 se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con PBS + 10% de FBS. Tras el lavado, las muestras se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo policlonal (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) contra neumococos (generado en conejo contra S. pneumoniae TIGR4 y D39 inactivados por calor). Como anticuerpo secundario se utilizó un anticuerpo anti-conejo de cabra marcado con fluorescencia Alexa-Fluor488 (Abcam) (1:500, 1 h, temperatura ambiente). La adherencia bacteriana se controló en al menos 20 células por cubreobjetos de clase mediante microscopía de fluorescencia. Cada experimento se repitió tres veces por duplicado. Todos los datos se presentan como medias ± d.s. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas no apareadas. En todos los análisis, un valor p de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Experimentos de fagocitosis

Ensayo de protección antibiótica: Una capa confluente de células monocíticas THP-1 (ATCC® TIB-202TM) cultivadas en placas de 24 pocillos (3 × 105 células por pocillo en RPMI-1640 (HyClone™) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS, Gibco)) se diferenció a fagocitos mediante la adición de 200 nmol ml-1 de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, Sigma-Aldrich) y se incubó durante 48 h a 37 °C y 5% de CO2. Después, las células THP-1 se lavaron con RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS inactivado por calor y se incubaron durante otras 24 h a 37 °C y 5% de CO2. Antes de la infección, los neumococos se cultivaron en THY hasta la mitad de la fase logarítmica (A 600 = 0,35-0,45), se centrifugaron y se lavaron con medio de infección (RPMI-1640 suplementado con un 1% de FBS inactivado por calor). Las células THP-1 se lavaron e infectaron con neumococos en 500 µl de medio de infección. La infección se sincronizó mediante centrifugación (2 min, 300×g) para iniciar un contacto simultáneo entre las bacterias y los fagocitos. A continuación, las células se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante diferentes períodos de tiempo. Tras la infección, las células se lavaron con el medio de infección y se incubaron con Penicilina G (100 unidades ml-1, Sigma-Aldrich) y Gentamicina (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) durante 1 hora a 37 °C y 5% de CO2 para eliminar las bacterias extracelulares. A continuación, se lavaron los fagocitos y se lisaron con saponina al 1% (Sigma-Aldrich) para liberar los neumococos intracelulares. Se determinaron las unidades formadoras de colonias (ufc) de bacterias intracelulares mediante la siembra de bacterias en diluciones adecuadas en placas de agar sangre (Oxoid)49. Se evaluó la eliminación dependiente del tiempo de los neumococos intracelulares mediante la eliminación de los neumococos extracelulares utilizando antibióticos como se ha descrito anteriormente. A continuación, los fagocitos se incubaron en medio de infección durante diferentes períodos de tiempo (0-3 h). Las ufc bacterianas intracelulares se monitorizaron como se ha descrito anteriormente. Todos los experimentos se repitieron cuatro veces por duplicado. Los datos se normalizaron en los ensayos de protección antibiótica a la multiplicidad de infección (MOI) o en la matanza dependiente del tiempo a las bacterias recuperadas en el punto de tiempo 0 h. Todos los ensayos se analizaron mediante ANOVA de una vía con corrección de Bonferroni.

Tinción de inmunofluorescencia doble y microscopía

Las células THP-1 diferenciadas por PMA (3 × 105 células por pocillo) se cultivaron en cubreobjetos de vidrio estériles (12 mm, Hartenstein) y se infectaron con neumococos como se ha descrito anteriormente. Tras la infección, las células THP-1 se lavaron con el medio de infección y se fijaron con paraformaldehído al 4% (Roth) durante una noche a 4 °C. Los cubreobjetos de vidrio se lavaron con PBS y se bloquearon con PBS + FBS inactivado por calor al 10% durante 1 h. Tras el lavado, las bacterias extracelulares se tiñeron utilizando una IgG policlonal α-neumococo (1:500) y una IgG secundaria de cabra α-conejo marcada con Alexa-Fluor488 (1:500, Abcam) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los cubreobjetos de vidrio se lavaron tres veces con PBS tras la permeabilización de las células THP-1 con Tritón X-100 al 0,1% en PBS (10 minutos, temperatura ambiente). Tras el lavado, se tiñeron los neumococos intracelulares utilizando una IgG policlonal α-neumococos (1:500) y una IgG secundaria de cabra α-conejo marcada con Alexa-Fluor568 (1:500, Abcam) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los experimentos se repitieron tres veces por duplicado. Para el análisis estadístico, se analizaron 50 células por cubreobjetos de vidrio para determinar el número de bacterias intracelulares. Los datos se normalizaron con respecto a la MOI. Todos los ensayos se analizaron mediante un ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni. En todos los análisis, un valor p de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Líneas celulares

Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se adquirieron de ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) y se ha comprobado que son negativas a los micoplasmas mediante PCR y microscopía electrónica de barrido.

Modelo de infección sistémica y neumonía aguda en ratones

Ratones CD-1 hembra de 8 a 10 semanas de edad (outbred, Charles River, Sulzfeld, Alemania) fueron infectados por vía intranasal con neumococos bioluminiscentes como se ha descrito recientemente50. Brevemente, los neumococos se cultivaron hasta la mitad de la fase exponencial (A 600 = 0,35) en medio THY que contenía un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor. Tras la centrifugación, la dosis de infección (20 µl) se ajustó a ~2,5 × 107 ufc en PBS (pH 7,4). Para la infección nasal, se anestesió a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Alemania; Rompun, Provet AG, Lyssach, Alemania), y se administraron las bacterias gota a gota en las fosas nasales. La ufc de la dosis de infección se confirmó mediante la siembra de diluciones seriadas del inóculo en placas de agar sangre. Se controló la supervivencia de los ratones y se obtuvieron imágenes de bioluminiscencia a intervalos preestablecidos mediante el sistema de imágenes IVIS® Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, EE.UU.). Para el modelo de infección sistémica, se administró una dosis de infección de 3 × 103 ufc por vía intraperitoneal en un volumen de 200 µl de PBS (pH 7,4). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la normativa alemana de la Sociedad para la Ciencia de los Animales de Laboratorio (GV-SOLAS) y la Ley Sanitaria Europea de la Federación de Asociaciones de Ciencias de Animales de Laboratorio (FELASA). Todos los experimentos fueron aprobados por el Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Alemania, permiso nº 7221.3-1-056/16-1).

Disponibilidad de los datos

Los archivos FASTQ en bruto que contienen los datos de la secuencia genómica de S. pneumoniae se enviaron al European Nucleotide Archive (ENA) del EMBL-EBI y se almacenaron en el Short Read Archive (SRA) con el número de acceso del estudio RJEB18558. Todos los demás datos pertinentes que apoyan las conclusiones del estudio están disponibles en este artículo y en sus archivos de información complementaria, o bien pueden solicitarse a los autores correspondientes.