El advenimiento de la medicina de «precisión» se caracteriza por numerosas mejoras en los métodos y regímenes diagnósticos, pronósticos y terapéuticos. Como parte de esta iniciativa, se ha hecho hincapié en minimizar la cantidad de tejido necesario para las pruebas mediante procedimientos menos invasivos y más seguros. Un método que ha despertado un gran interés en los últimos años es la «biopsia líquida». Aunque las definiciones varían en cuanto al significado exacto de este término, puede considerarse, en términos generales, como la recogida de una muestra de fluido corporal para analizar los biomarcadores relevantes con el fin de informar sobre el tratamiento del paciente. Se aplica más comúnmente a la recogida de sangre periférica para el análisis de ácidos desoxirribonucleicos (ADN) tumorales circulantes libres de células.

La primera descripción de ADN circulante libre de células en la sangre humana se realizó en 1948, pero esto suscitó poca atención en la comunidad científica en general 2. En 1977, los científicos identificaron la presencia de niveles anormalmente altos de ADN libre de células (cfDNA) en el plasma y el suero de pacientes con cáncer en relación con los pacientes de control de salud y se presumió que este cfDNA representaba principalmente el ADN tumoral circulante (ctDNA)1,5. Desde esta descripción original, otras investigaciones han descubierto que el aumento del cfDNA refleja generalmente una multitud de procesos patológicos, entre los que se incluyen las condiciones neoplásicas malignas y benignas, las enfermedades inflamatorias, los accidentes cerebrovasculares, los traumatismos y la sepsis. Durante estos procesos, los ácidos nucleicos pueden ser vertidos a la sangre por las células apoptóticas y necróticas o por la secreción controlada de las células vivas2,11. Aunque el ADN libre de células se utiliza a menudo como sinónimo de ADN tumoral circulante, hay que recordar que el ADN circulante no tumoral y no humano también puede estar presente en una muestra.

Aunque el enfoque actual está dominado por el ADN, los componentes adicionales de una biopsia líquida incluyen los ácidos ribonucleicos (ARN), las células tumorales circulantes (CTC), las vesículas extracelulares (EV) y las plaquetas educadas por el tumor (TEP). Estos últimos componentes son principalmente de interés para la investigación. A medida que se realiza más investigación traslacional, estos componentes adicionales de una biopsia líquida pueden tener un uso clínico creciente en el futuro. Una revisión de estos elementos va más allá del alcance de este artículo y se remite al lector al artículo de Batth et al para una mayor lectura.

Consideraciones tecnológicas

Hasta hace poco, la tecnología disponible no ha sido lo suficientemente sensible como para detectar el ctADN y darle un uso significativo. A diferencia de los ensayos moleculares realizados en fluidos corporales para la detección de ácidos nucleicos de virus y otros microorganismos, que se benefician de cantidades relativamente grandes de ácidos nucleicos, los fragmentos de ácidos nucleicos tumorales circulantes están presentes en una fracción del cfDNA normal no tumoral. El ctDNA son generalmente pequeños fragmentos de ADN en el rango de 140-170 pares de bases (bp)3, y el tipo de tumor, la progresión, la carga, las tasas de proliferación y la terapia afectan a la cantidad de ctDNA en una muestra. Además, aunque el ctADN es relativamente estable en el plasma y el suero, es eliminado de la circulación por el hígado y los riñones en cuestión de horas 3,4. No obstante, los avances en los procesos preanalíticos y los métodos de purificación han permitido la captura, la amplificación y la secuenciación del ctADN con éxito.

Los métodos que se utilizan actualmente para detectar o medir el ctADN pueden dividirse a grandes rasgos en dos categorías: los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los basados en la secuenciación de próxima generación (NGS). Los ensayos basados en la PCR suelen tener un tiempo de respuesta más rápido y son menos costosos, pero normalmente sólo pueden evaluar una o unas pocas mutaciones específicas a la vez (capacidad de multiplexación limitada). Los enfoques basados en la PCR pueden subdividirse a su vez en métodos que enriquecen las secuencias mutantes en relación con las de tipo salvaje (no mutantes) y los que logran la cuantificación por compartimentación. Un ejemplo de este último grupo es la «PCR digital», que se está utilizando ampliamente para la detección y cuantificación de mutaciones específicas y conocidas en el ADNc. La PCR se compartimenta en miles de pequeños volúmenes de reacción individuales, ya sea en un chip o creando gotas de agua en aceite. Cada compartimento o gota contiene o no un fragmento de plantilla objetivo y produce una señal fluorescente si un fragmento de plantilla apropiado está presente dentro de ese volumen. Contando los volúmenes fluorescentes individuales, es posible estimar el número de moléculas de plantilla específicamente dirigidas en la muestra. En el caso de múltiples objetivos analizados a la vez (multiplexación), pueden asignarse diferentes señales fluorescentes a secuencias de variantes específicas.

Los enfoques basados en la secuenciación de próxima generación permiten evaluar una gama mucho más amplia de posibles mutaciones, ya que la secuenciación puede detectar mutaciones que se produzcan en cualquier parte de las regiones capturadas. Para seleccionar las regiones del genoma propensas a las mutaciones, se pueden preparar bibliotecas de NGS a partir de ADN plasmático utilizando métodos de captura de ligadura/híbridos o métodos de enriquecimiento por PCR dirigida. Las fracciones de alelos variantes son generalmente mucho más bajas en las biopsias líquidas que en las biopsias de tejido, a menudo <1%, por lo que las regiones de interés deben secuenciarse más profundamente que en la NGS de tejido tumoral primario. Además, es necesario optimizar ampliamente los procesos preanalíticos y analíticos para maximizar la muestra de entrada y reducir los errores de PCR y secuenciación. Los enfoques de NGS tienen la importante ventaja de poder lograr una cobertura de mutaciones mucho más amplia (análisis simultáneo de miles de posibles mutaciones). Por lo tanto, no es necesario el conocimiento previo de las mutaciones específicas del tumor. Sin embargo, en comparación con los métodos más sencillos basados en la PCR, las técnicas de NGS son más caras, requieren más tiempo y suponen un mayor desafío técnico.

Ventajas y desventajas

Las ventajas de las biopsias líquidas radican principalmente en la naturaleza mucho menos invasiva de los procedimientos para obtenerlas en relación con las biopsias tumorales estándar. Consideremos, por ejemplo, el proceso de biopsia de una masa pulmonar. Si la masa se encuentra en un lugar al que se puede acceder mediante radiología intervencionista o biopsia quirúrgica, existe el riesgo de neumotórax o hemorragia, sin contar con el coste de mantener una sala de operaciones en la que realizar la intervención. Las biopsias líquidas también permiten realizar muestreos más frecuentes y seriados a lo largo del tiempo para proporcionar una mayor resolución al comportamiento de los tumores, así como su respuesta a la terapia. Por ejemplo, en un estudio los pacientes con cáncer colorrectal que posteriormente demostraron radiográficamente una buena respuesta al tratamiento tuvieron un descenso de >90% de los niveles de ctDNA tras las primeras 2 semanas de tratamiento 9. Se ha demostrado que esto estratifica el riesgo de recidiva tras la resección con intención curativa. En otro estudio, las pacientes con cáncer de mama con ADNc detectable después de la resección tenían un riesgo 25 veces mayor de recurrencia 10. Estos conceptos son análogos a las pruebas que se realizan actualmente para las neoplasias hematológicas, como la leucemia mielógena crónica (LMC) y las pruebas en serie para detectar la presencia de transcripciones de fusión BCR-ABL. Por último, en los casos en los que no se disponga de una biopsia de tejido, se pueden realizar perfiles moleculares de los tumores a través de la biopsia líquida.

Las desventajas importantes de la biopsia líquida incluyen la necesidad de obtener un diagnóstico histológico inicial mediante una biopsia de tejido. Los laboratorios que realizan estos ensayos deben ser conscientes de la utilización adecuada de las pruebas y del potencial de «sobreinterpretación» en el contexto clínico. La baja frecuencia de variantes dentro de la sangre periférica puede dar lugar a mayores tasas de falsos negativos y requerir un esfuerzo técnico y una experiencia significativamente mayores para obtener resultados fiables.

Aplicaciones actuales y emergentes

El uso clínico de la biopsia líquida ha aumentado significativamente desde 2014, cuando la primera plataforma de biopsia líquida multigénica disponible comercialmente estuvo disponible. Hay varios ensayos disponibles comercialmente y aprobados por la FDA, y algunos son considerados como suficientes para la elegibilidad del tratamiento por las compañías de seguros. Por ejemplo, en 2016 la FDA aprobó la prueba cobas® EGFR Mutation v2 para determinar la elegibilidad de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas para recibir ciertos inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR . La adopción de la biopsia líquida para excluir a los pacientes de la terapia dirigida ha visto una adopción clínica mucho más lenta, sobre todo debido a la preocupación por los falsos negativos y el tejido tumoral generalmente accesible 3. El aumento de la utilización clínica también ha sido impulsado por los pacientes y los médicos que desean identificar las mutaciones seleccionables para su uso fuera de lo indicado o para la inscripción en ensayos clínicos.

Los usos emergentes de las biopsias líquidas incluyen su uso como complemento del perfil mutacional de la biopsia de tejido, la evaluación de la respuesta al tratamiento, la supervisión de la enfermedad residual, la detección de la recurrencia de la enfermedad y la supervisión de la aparición de mutaciones de resistencia 3.

Direcciones futuras

La esperada especificidad del cáncer de las mutaciones hace que el ctDNA sea un biomarcador atractivo para la detección temprana del cáncer, lo que podría tener un enorme impacto en el cuidado de los pacientes. Sin embargo, como se sabe que los tumores en fase inicial liberan muy poco ADN, hay que superar muchos retos técnicos. Aunque la biopsia líquida puede ser una herramienta atractiva para el cribado del cáncer en pacientes asintomáticos, estas aplicaciones tendrán que ser consideradas de forma cuidadosa y reflexiva para evitar el excesivo sufrimiento de los pacientes y los costes derivados de los falsos positivos. A corto plazo, las biopsias líquidas pueden ser más útiles para confirmar la malignidad en pacientes con lesiones ya aparentes desde el punto de vista clínico o radiográfico.

Conclusión

La literatura centrada en las pruebas de ctDNA se está expandiendo y evolucionando rápidamente. Las áreas de investigación en curso incluyen los procesos preanalíticos, los factores que afectan a la tasa de detección del ctADN y los ensayos clínicos prospectivos. Es probable que veamos un papel más prevalente del ctADN en la atención clínica, ya que la investigación continua sobre CTC, cfADN/ARN y vesículas extracelulares proporcionará una mayor resolución a la instantánea del estado del tumor obtenida a través de las biopsias líquidas 4.