Ensayos biológicos de bradicinina y kininas relacionadas
Las kininas son potentes agentes hipotensores en todas las especies animales estudiadas (54). El ensayo in vivo más común para estos péptidos es el de la presión sanguínea en ratas, descrito anteriormente. Los efectos vasodilatadores de las kininas se miden en órganos perfundidos aislados con endotelio intacto, según el procedimiento descrito en la Sección IV. El efecto relajante de las kininas en los vasos arteriales se evalúa in vitro en la arteria carótida del perro (57) utilizando el método descrito por Regoli y Barabé (34). El efecto venoconstrictor se mide in vitro en la vena yugular del conejo (42), según el procedimiento que se resume a continuación.
Las venas, tomadas de conejos (1,0-2,0 kg), se cortan en tiras helicoidales de 2 mm de ancho y 2 cm de largo y se suspenden en solución de Krebs (oxigenada a 37°C) que contiene un inhibidor de la enzima convertidora (Captopril, 10 μM) para evitar la degradación de las quinas (34). Las contracciones del tejido en respuesta a las quinas se registran como se ha descrito anteriormente y se suelen medir las curvas completas de concentración-respuesta para evaluar las afinidades de las quinas y sus antagonistas. Se ha demostrado que la vena yugular de conejo contiene un subtipo de receptor B2 (B2A) (Tabla V).
La preparación no vascular más utilizada es el íleon de cobaya, que se toma de cobayas de 250-350 g y se prepara como una tira de músculo liso longitudinal, según Rang (37). El tejido se suspende in vitro en solución de Krebs (oxigenada a 37°C) y sus cambios de tensión se miden como se ha descrito anteriormente para los vasos aislados (véase la sección I). El íleon de cobaya es la preparación utilizada para caracterizar el subtipo de receptor B2B (Tabla V).
Los receptores B1 se estudian utilizando la tira de aorta de conejo, preparada y manipulada de la misma manera que para la angiotensina. El tejido es casi insensible a las cininas, en particular al desArg9BK, el agonista del receptor Bt, al principio del experimento. La sensibilidad del tejido aumenta a lo largo de varias horas (hasta 6-10 horas) de incubación a medida que los receptores B1 se forman de novo (55). Los efectos contráctiles de las cininas se registran y analizan utilizando los mismos instrumentos y enfoques descritos en la Sección I para la angiotensina. Los tejidos de los conejos pueden sensibilizarse a la desArg9BK mediante el tratamiento previo de los animales con lipopolisacárido (LPS), que se inyecta por vía intravenosa 5 horas antes de matar al animal (56). Se ha investigado el mecanismo de generación del receptor B1 por el LPS (60, 61). Las aortas y otros tejidos tomados de conejos tratados con LPS responden al desArg9BK desde el principio de la incubación in vitro (56). De forma similar, las arterias renales de perros expresan receptores B1 de forma espontánea y muestran una alta sensibilidad a la desArg9BK (62).
Se han utilizado varios compuestos para caracterizar los receptores de quinas en órganos aislados, utilizando las respuestas biológicas (contráctiles) de tres preparaciones (Tabla V). Las bradiquininas y la calidina son potentes estimulantes de la vena yugular del conejo (RJV) y del íleon del cobayo (GPI), mientras que la desArg9BK y la Lys,desArg9BK son inactivas. El orden opuesto de potencia se observa en la aorta de conejo (AR). desArg9BK es un antagonista sólo en la AR. Sobre estas bases, Regoli y Barabé (54) propusieron la hipótesis de dos receptores de kinina, el B1 (AR) y el B2 (RJV, GPI, y muchas otras preparaciones y pruebas) que fue caracterizado inicialmente sólo con agonistas (54) y posteriormente (véase más adelante) ha sido caracterizado con antagonistas. Los antagonistas del receptor B2 fueron identificados por Vavrek y Stewart (63) y posteriormente mejorados por varios investigadores (64-66) mediante la sustitución de Pro3 por hidroxiprolina (Hyp), por la adición de un d-Arg al extremo N, por la sustitución de Phe8 por Leu, y por la sustitución del dipéptido Pro7-Phe8 por d-Tic-Oic (67-69). En la tabla V se presenta un prototipo de cada serie de antagonistas para indicar que la b-2-tienil-elanina (Thi) no es necesaria en las posiciones 5 y 9, mientras que la Hyp3 y la d-Arg0 son importantes para la afinidad, especialmente en la VJR. La sustitución de Phe8 por Leu, sumada a las demás modificaciones, da lugar a la d-ArgBK, que (a) está casi desprovista de actividad agonística, y (b) es activa en la RJV, menos activa en la GPI, y bastante pobre en la RA (B1), y por tanto es bastante selectiva para el sitio B2. La diferencia entre los valores de pA2 (en dos unidades logarítmicas) entre el RJV y el GPI es un hallazgo determinante para la subdivisión propuesta (Tabla V) de los receptores B2 en B2A (RJV) y B2B (GPI). El D-ArgBK es un antagonista competitivo, rápidamente reversible tanto in vivo como in vitro y es diferente del Hoe 140, que es no competitivo (sin equilibrio), probablemente porque tiene una interacción prolongada con los sitios B2A y B2B (59, 67, 68, 70). La distinción entre B2A y B2B está apoyada por los resultados obtenidos con los dos últimos compuestos (Tabla V), que se diferencian por el residuo en la tercera posición. La presencia de Hyp favorece el antagonismo (pA2 7,6) en el B2A y la actividad agonística parcial en el B2B, mientras que Tyr3 da un potente agonista en el B2A y un antagonista bastante bueno (antagonista puro) en el B2B. Esta nueva clasificación ha sido presentada en un artículo de revisión (71). Los sitios funcionales de la kinina son pues B, y B2 (se contemplan dos subtipos). Se han propuesto otros receptores (B3, B4 y B5) (72-74), pero su existencia no se ha demostrado con datos experimentales sólidos (véase la revisión crítica en la Ref. 59). La liberación de histamina inducida por las cininas en los mastocitos peritoneales de rata es un fenómeno inespecífico que se ha atribuido al carácter catiónico de las cininas (75, 76).