Carlos V tuvo que buscar otro retrato, desde Austria el que Isabel de Portugal envió a Margarita antes de morir. Su hermana envió el retrato en noviembre Carlos se sintió muy decepcionado porque no parecía uno para su esposa. Estando descontento con el retrato tuvo que pedir a Tiziano que encontrara un arte que se pareciera a su esposa.
Tiziano pintó el retrato de Isabel en 1545, Tiziano lo amuebló y la esposa de Carlos tenía un vestido negro y en su regazo tenía flores detrás de ella tenía una magnífica corona. En el palacio de EI Pardo este arte fue destruido con un incendio esta historia esta en grabados y varias copias. El retrato había perdido la nariz así que Carlos lo llevó a Augsburgo para que el artista pudiera trabajar en él para repintar la nariz. En septiembre del año 1548 el artista utilizó el modelo antiguo para hacer el actual y también fue pintado en Augsburgo. Carlos e Isabel tuvieron un retrato juntos y un duplicado en la colección de la Fundación Casa de Alba en Madrid este fue el mejor y el primer binomio de Isabel de Portugal y Carlos V.
El arte de Tiziano traía recuerdos de Isabel de Portugal y el que tenían ambos recordaba a Carlos su esposa. Carlos solicitaba las artes y no quería cuadros exactos sino que quería visualizar los que tenía en su mente. Carlos quería que Tiziano pintara el retrato de la nariz perdida porque podía pintarlo tal y como aparecía la nariz. Los retratos realizados durante su vida parecían reales mostraban como Isabel de Portugal tenía una nariz aguileña esto, era un rasgo único que fue notado por muchos. Tiziano tuvo que hacer la misma corrección de la clásica nariz recta a la curva que tenía Isabel de Portugal. Las pequeñas cosas en los retratos que traían recuerdos de Isabel hicieron que Carlos mantuviera las artes cerca y todo esto se mantiene en documentos como el de Yuste y el de Bruselas donde este último fue documentado en 1556 y el primero en 1558.
Los retratos que hizo Tiziano fueron cercanos a los de Giulio Romano. El de Eleonora Gonzaga una duquesa de Urbino es lo que Tiziano miró y utilizó las habilidades en las pinturas para hacer retratos de Isabel. Las imágenes de Isabella de Portugal fueron en cierto modo un reto, ya que no se trataba de una realidad sino sólo de una para traer recuerdos. Los retratos de Isabella de Portugal fueron un gran trabajo realizado por Tiziano, sin embargo, si se mira de cerca se ve que el lienzo utilizado fue previamente un arte de una mujer. El lienzo que pintó Isabel de Portugal fue regalado a María, hermana de Felipe II. Fue para un convento llamado Descalzas Reales. En 1636 fue llevado al Alcázar de Madrid donde permaneció durante los mismos años hasta que se produjo un incendio en 1734.