Las interacciones biomoleculares son fundamentales para la gran mayoría de los procesos celulares, y la identificación de los principales componentes que interactúan suele ser el primer paso hacia la comprensión de los mecanismos que rigen diversas funciones celulares. Por ello, los análisis estadísticos de imágenes que pueden realizarse en imágenes de microscopía de fluorescencia de células fijas o vivas se han aplicado de forma rutinaria para estudios biofísicos y de biología celular. Estos enfoques miden la fracción de partículas que interactúan mediante el análisis de imágenes de fluorescencia de doble color para los píxeles colocalizados. Los algoritmos de colocalización han demostrado ser eficaces, aunque el rango dinámico y la precisión de estas mediciones nunca han sido bien establecidos. La espectroscopia de correlación cruzada de imágenes espaciales (ICCS), que correlaciona de forma cruzada las fluctuaciones de intensidad espaciales registradas en las imágenes de dos canales de detección simultáneamente, también ha demostrado recientemente ser una medida eficaz de la colocalización. A través de simulaciones, imágenes de anticuerpos fluorescentes adsorbidos en vidrio y mediciones de células, mostramos que ICCS funciona mucho mejor que los algoritmos de colocalización estándar a densidades de partículas de moderadas a altas, que a menudo se encuentran en los sistemas celulares. Además, se encontró que la relación de densidad entre las dos especies marcadas de interés juega un papel importante en la precisión del análisis de colocalización. Aplicando una comparación directa y sistemática entre el algoritmo estándar de colocalización por microscopía de fluorescencia y el ICCS espacial, mostramos los regímenes en los que cada enfoque es aplicable y, lo que es más importante, en los que no dan resultados precisos.