Empleamos fuentes de nutrientes de glucosa, glucosa y glutamina para descifrar el flujo de carbono en las células K562 y los cambios en respuesta al tratamiento con BaP. En general, observamos la mayor cantidad de incorporación de la etiqueta en las moléculas de ribosa y en el lactato (ver y Archivo adicional 1: Figura S1 para los detalles de las distribuciones de la etiqueta). Como se ilustra en la Fig. 1, se puede esperar que la incorporación de la etiqueta en el ciclo de Krebs que surge de la glucosa produzca dos patrones de etiquetado distintos de los metabolitos del ciclo de Krebs, dependiendo de si el fragmento C2 entra a través de la piruvato carboxilasa (PC) o de la piruvato deshidrogenasa (PDH). El piruvato formado a partir de la glucosa producirá glutamato a través de la PDH, pero el glutamato a través de la actividad de la PC. Como la actividad de la PC produce oxaloacetato a partir del piruvato, se espera que el malato derive de la PC, mientras que el producto de la PDH será malato o malato.

Los espectros de RMN indican que grandes cantidades de aspartato y malato son derivados de la PC

Como se muestra en la Fig. 2, se observan diferencias significativas entre las células que procesan glucosa durante 3 vs. 24 h para las resonancias de malato y aspartato. Estas diferencias se manifiestan predominantemente en un cambio de las constantes de acoplamiento de RMN. El tamaño de estas constantes de acoplamiento depende de la naturaleza del átomo de carbono adyacente: un grupo de ácido carboxílico produce una constante de acoplamiento mucho mayor que un grupo CH2. La constante de acoplamiento para la fracción 13C1 13C2 en el aspartato o el malato es de unos 50-60 Hz, mientras que la constante de acoplamiento para una fracción 13C2 13C3 es de unos 35-40 Hz.

Para un periodo de etiquetado de 24 horas, la Fig. 2 muestra constantes de acoplamiento aparente de 53 Hz para C2 de malato y aspartato. Esta gran constante de acoplamiento aparente muestra que predomina el acoplamiento de C2 con el grupo de ácido carboxílico C1 adyacente. Este patrón de acoplamiento 13C1 13C2 (y también 13C3 13C4, véase el archivo adicional 1) surge de la actividad de la PDH y posiblemente también de los metabolitos que pasan varias veces por el ciclo de Krebs durante un periodo de etiquetado más largo.

Para el periodo de etiquetado corto de 3 horas, se observan las constantes de acoplamiento aparente más pequeñas de 47 y 41 Hz para C2 (Fig. 2 y archivo adicional 1: Figura S1), lo que indica que domina el acoplamiento al metileno adyacente C3. La presencia de la fracción 13C2 13C3 en periodos de etiquetado más cortos muestra que el producto que surge de la actividad de la PC domina para periodos de etiquetado más cortos.

Debe tenerse en cuenta que las divisiones de señal observadas no representan las constantes de acoplamiento escalares precisas en una mezcla de compuestos etiquetados. Sin embargo, el cambio observado proporciona una clara indicación de mayores cantidades del producto PC a periodos de etiquetado más cortos tanto en el malato como en el aspartato.

Pruebas adicionales de la actividad PC en los subespectros del uracilo

En la síntesis de novo de pirimidinas, el uracilo se forma a partir del aspartato a través del carbamoil-aspartato, el orotato y el dihidroorotato. Por lo tanto, los patrones de etiquetado en el aspartato deberían reflejarse en las señales del anillo de pirimidina. Archivo adicional 2: La figura S2 muestra las incorporaciones de etiquetas esperadas para el uracilo. Cuando la base uracilo en el UDP se sintetiza a partir del aspartato, el destino de los 13Cs es el siguiente: C1, C2 y C3 del aspartato se convierten respectivamente en C10, C11 y C12 del UDP, mientras que C4 se pierde (ver archivo adicional 2). En los espectros HSQC, sólo el C11 y el C12 pueden ser observados directamente, ya que el C10 no tiene un protón unido.

Para las muestras marcadas con glucosa, el aspartato derivado del PC será marcado con C2C3. Este se convierte en un fragmento C11C12 etiquetado en UDP. Sin embargo, el aspartato derivado de la PDH puede ser etiquetado en C1C2 o C3C4. Esto se traduce en C10C11 o en un C12 aislado en el uracilo, respectivamente. Por lo tanto, los espectros de C12 son indicativos de las cantidades relativas de PC frente a la actividad de PDH; la PC produce un doblete para C12, mientras que la PDH produce un singlete en C12.

Todos los espectros mostraron tanto las señales de singlete como de doblete en C12 (Fig. 3). Sin embargo, la intensidad del doblete en relación con el singlete cambió entre los datos de 3 y 24 h por un factor de tres, indicando de nuevo un cambio de etiquetado mediado por PC a PDH con el tiempo. La imagen que emerge de varios metabolitos es que hay una actividad paralela tanto de la PC como de la PDH, pero el producto de la PC se canaliza principalmente en productos directamente ligados al oxaloacetato, dando lugar a la elevada cantidad observada de producto de la PC en estos metabolitos en una exposición a corto plazo. Sólo en períodos de etiquetado más largos se observa el producto de la PDH en la rama izquierda del ciclo de Krebs.

El malonato inducido por BaPEl malonato inducido por el BaP se deriva de la actividad descendente de la PC en las células K562

Hemos demostrado que el malonato puede formarse a partir del oxaloacetato por conversión química bajo la influencia del peróxido de hidrógeno y sugerimos en nuestro estudio anterior que la acumulación de malonato en respuesta al tratamiento con BaP fue impulsada por la elevación inducida por el tratamiento de las ERO que actúan sobre el oxaloacetato . Las muestras fueron adicionadas con malonato para confirmar nuestra asignación de las resonancias de metileno 1H/13C del malonato en los espectros HSQC (ver archivos adicionales 3 y 4). Posteriormente, en este estudio, nuestro enfoque basado en el trazador nos ha permitido considerar los orígenes del malonato observado.

Como se muestra en la Fig. 4a, se esperaría que el malonato derivado de ROS que surge del oxaloacetato que se ha formado directamente a partir del piruvato por la actividad de la PC utilizando glucosa como fuente de nutrientes se etiquetara en las posiciones C1 y C2. En la situación alternativa de que la actividad de la PDH convierta el piruvato en acetil-coA al entrar en el ciclo de Krebs, se esperaría que la conversión mediada por ROS del oxaloacetato resultante en malonato diera lugar a dos productos con etiqueta en la posición C1 o en la C1 y C2 en una proporción 1:1 porque el ciclo de Krebs pasa por succinato y fumarato simétricos (véase también la Fig. 1).

La figura 4b muestra un corte representativo 1D de los espectros HSQC procedentes de células marcadas con glucosa tratadas con BaP durante 24 horas y demuestra claramente la generación de una fuerte señal de malonato inducida por el fármaco. En los correspondientes espectros HSQC procedentes de células marcadas con glucosa tratadas con BaP durante 24 horas, observamos un claro doblete (Fig. 4c mostrado como picos rojos) con una separación de 58 Hz, indicativo de un grupo CH2 marcado acoplado a un carbono de ácido carboxílico. Esto es una clara indicación de un malonato etiquetado en C1,C2 (o C2,C3) con etiqueta en sólo uno de los dos grupos de ácido carboxílico. Se esperaría que el malonato etiquetado en las tres posiciones que podría surgir de múltiples pasajes a través del ciclo de Krebs mostrara un triplete en el C2 en la dimensión 13C de los espectros HSQC, ya que al menos un porcentaje estaría etiquetado en ambos grupos COO (patrón de acoplamiento AX2). Por lo tanto, la ausencia de una señal central en el HSQC es altamente indicativa de que el malonato se deriva de la actividad de la PC aguas arriba. La ausencia de malonato derivado de múltiples ciclos de Krebs y de la actividad de la PDH también se ve apoyada por el hecho de que el malonato derivado del etiquetado de 24 horas de las células tratadas con BaP con glucosa sólo mostró un singlete (la Fig. 4c se muestra como pico azul).

Para probar aún más que el malonato inducido por el fármaco se deriva aguas abajo de la actividad de la PC, adquirimos espectros 13C-1D en los que pudimos observar las resonancias COO del malonato directamente (Fig. 4d). Un espectro de referencia de 10 mM de ácido malónico en el mismo tampón (pH 7) utilizado para los extractos celulares confirmó la frecuencia de la resonancia COO (Fig. 4d).

Se espera que el etiquetado mediado por PC produzca un doblete en C1 (derivado del malonato), mientras que se espera que el etiquetado mediado por PDH dé una mezcla 50:50 de un doblete derivado del malonato y un singlete derivado del malonato (Fig. 4a). Aunque con ruido, incluso después de 24 horas de adquisición, los espectros derivados mostraron un claro doblete sin señal residual en el centro (Fig. 4d) confirmando que el producto de etiquetado derivado de la PC es dominante. A partir de esto, concluimos que el malonato se deriva efectivamente de la conversión de oxaloacetato mediada por ROS que se origina completamente o al menos predominantemente de la actividad de la PC y no muestra ninguna contribución de un posible producto de la PDH incluso después de un período de etiquetado de 24 horas. Los experimentos de control en los que se utilizó glutamina como fuente de carbono sólo mostraron una mínima incorporación de la etiqueta en el malonato. El malonato producido a partir de la glucosa se etiquetó predominantemente a través de la PC. Juntos, estos dos hechos sugieren fuertemente que el malonato se produce predominantemente a partir de la glucosa a través de la glucólisis y la entrada de piruvato en el ciclo TCA mediada por la PC.

Evidencia de la actividad paralela de la PDH

La tabla 1 compara las constantes de acoplamiento de 1 J CC y los patrones de intensidad de los multipletes observados en los conjuntos de datos de 3 y 24 h etiquetados. Tanto en los conjuntos de datos de 3 como de 24 h, el etiquetado en C4 del glutamato es mucho mayor que el etiquetado en C4 y el desdoblamiento visto en C4 indica el acoplamiento a C5. Esto sugiere fuertemente que el etiquetado mediado por la PDH es dominante para el glutamato en ambos puntos de tiempo. El citrato C2 está dividido por un gran acoplamiento a C1, lo que sugiere de nuevo que el etiquetado mediado por la PDH es dominante. Estos patrones de etiquetado indican un claro dominio de los productos de la PDH para la rama derecha del ciclo de Krebs, que lleva del citrato al glutamato.

Análisis computacional de multipletes

También se analizaron cuantitativamente los cortes del 1H-13C-HSQC simulando los espectros de 13C-NMR para una mezcla de diferentes isotopómeros utilizando el software pyGamma desde el software NMRLab . Para el glutamato, el análisis de multipletes confirmó que el etiquetado mediado por la PDH era dominante tanto a las 3 como a las 24 horas, independientemente del tratamiento con BaP. Para el aspartato, el análisis de multipletes confirmó que había un cambio del etiquetado mediado por PC a las 3 h hacia el etiquetado mediado por PDH a las 24 h. Los espectros simulados se muestran en el archivo adicional 5: Figura S4, y la Tabla 2 confirma los resultados cualitativos para el aspartato y el glutamato.