Abstract

El metabolismo celular depende de la concentración adecuada de fosfato inorgánico (Pi) intracelular. Los genes que responden a la falta de Pi parecen estar implicados en múltiples vías metabólicas, lo que implica un complejo sistema de regulación del Pi en microorganismos y plantas. Se requiere un grupo de enzimas para la absorción y el mantenimiento de niveles adecuados de fosfato, que se libera a partir de ésteres y anhídridos de fosfato. El sistema de las fosfatasas es especialmente adecuado para el estudio de los mecanismos de regulación porque la actividad de las fosfatasas se mide fácilmente con métodos específicos y la diferencia entre los niveles reprimidos y desreprimidos de la actividad de las fosfatasas se detecta fácilmente. En este trabajo se analiza el sistema de proteínas fosfatasas inducido durante la inanición de fosfato en diferentes organismos.

1. Introducción

La regulación de los procesos celulares, como la diferenciación celular, la proliferación, la muerte celular, la movilidad, el metabolismo, la supervivencia y la organización del citoesqueleto, en respuesta a algunos estímulos es fundamental para todos los aspectos de la vida celular . La fosforilación de proteínas es uno de los mecanismos más utilizados para regular estos procesos. Los procesos que son controlados reversiblemente por la fosforilación de proteínas requieren tanto una proteína quinasa como una proteína fosfatasa .

Tradicionalmente, las proteínas quinasas se han estudiado más intensamente que las proteínas fosfatasas debido a la visión anterior de que las proteínas quinasas confieren una regulación fina a la fosforilación de proteínas, mientras que las proteínas fosfatasas simplemente actúan para eliminar grupos fosfato. Sólo en la última década se comprendió que las proteínas fosfatasas también están reguladas por una variedad de mecanismos y no son menos importantes para la fisiología celular que las proteínas quinasas . Las proteínas fosfatasas son capaces de hidrolizar metabolitos fosfomonoésteres, liberando fosfato inorgánico (Pi) de estos sustratos .

El fósforo, en forma de fosfato inorgánico (Pi), es uno de los macronutrientes más importantes para todos los organismos . No sólo se utiliza en la biosíntesis de los componentes celulares, como el ATP, los ácidos nucleicos, los fosfolípidos y las proteínas, sino que también interviene en muchas vías metabólicas, como la transferencia de energía, la activación de proteínas y los procesos metabólicos del carbono y los aminoácidos . Se necesitan grandes cantidades de fosfato para la supervivencia de las células. En las plantas, el Pi es esencial para el crecimiento y el desarrollo. En los hongos, la vía de transducción de señales de Pi regula la expresión de muchos genes que responden al fosfato y que participan en la captación de Pi de fuentes extracelulares. En los parásitos tripanosomátidos, el Pi influye en su capacidad para crecer y colonizar correctamente en el huésped invertebrado.

En resumen, las proteínas fosfatasas y quinasas son necesarias para la homeostasis del Pi durante su adquisición, almacenamiento, liberación e integración metabólica. El propósito de este trabajo es resumir la regulación de las fosfatasas por el fosfato inorgánico, con énfasis en el papel de estas enzimas en la biología celular.

2. Control de retroalimentación de las fosfatasas por el fosfato inorgánico: La vía PHO

Saccharomyces cerevisiae tiene varias fosfatasas con diferentes especificidades, localización celular y permeasas utilizadas en la captación de Pi. El conjunto de genes responsables de estas actividades son reprimidos coordinadamente por la concentración de Pi en el medio de crecimiento . La adquisición, almacenamiento, liberación e integración metabólica del Pi por parte de la célula requiere la participación de muchas enzimas esenciales como las fosfatasas ácidas extracelulares (APasas), las fosfodiesterasas, los transportadores de Pi, las polifosfato quinasas, las fosfatasas alcalinas (ALPasas) y las endopolifosfatasas . Las actividades de estas enzimas están intrínsecamente ligadas a la homeostasis del Pi, y están sujetas a la regulación a través de la vía de transducción de señales de Pi (PHO) en respuesta a los niveles variables de Pi.

En un modelo actual para la regulación de PHO, el regulador positivo (o factor positivo) Pho4p, codificado por el gen PH04, es indispensable para la activación transcripcional de los genes PHO por su actividad y localización. En un medio con alto contenido de Pi, un complejo de quinasas dependientes de ciclinas (CDK) formado por Pho80p y Pho85p inhibe la función de Pho4p por hiperfosforilación. La Pho4p hiperfosforilada permanece en el citoplasma y es incapaz de activar la transcripción de los genes PHO . Cuando la concentración de Pi en el medio es suficientemente baja, Pho81p inhibe la función del complejo Pho80p-Pho85p , permitiendo que Pho4p se reubique en el núcleo y active la transcripción de los genes PHO . Estos genes codifican para los transportadores de alta afinidad Pho84p y Pho89p; las fosfatasas ácidas secretadas Pho5p, Pho11p, y Pho12p; otras proteínas relacionadas que aumentan la recuperación de Pi a partir de fuentes extracelulares .

Esta vía PHO ha sido descrita en diferentes organismos como plantas , bacterias y hongos .

3. El sistema de fosfatasas en la levadura

Inicialmente, se observó que varios genes de fosfatasas son modulados por la concentración de Pi en el medio de cultivo; así, la vía PHO fue inicialmente caracterizada por fosfatasas diferencialmente expresadas .

En S. cerevisiae, la transcripción de los genes que codifican las fosfatasas ácidas y alcalinas y el transportador de Pi es reprimida y desreprimida coordinadamente dependiendo de la concentración de Pi en el medio de cultivo . La mayoría de las fosfatasas sintetizadas en condiciones de limitación de Pi se localizan extracelularmente o se asocian a la membrana plasmática o a la pared celular.

Los genes de fosfatasas regulados por Pi incluyen PHO5 , que codifica para la mayor fracción de fosfatasas ácidas reprimibles (rAPasa; pH óptimo 3-4; EC 3.1.3.2), y sus isozimas PHO10 y PHO11 . Estas tres rAPasas son glicoproteínas que se encuentran en la pared celular o en el espacio periplásmico. Son responsables de la captación de fosfato y trabajan en conjunto con transportadores de alta afinidad para adquirir fosfato cuando la concentración de Pi en el ambiente es baja . La rAPasa codificada por el gen PHO5 se glicosila durante la secreción a través de la membrana y se localiza en el espacio periplásmico . Pho5p es responsable del >90% de la actividad de la APasa.

Debido a que el producto del gen PHO5 constituye la mayor parte de las fosfatasas ácidas, la regulación de PHO5 es clave para la homeostasis celular del fosfato. Los activadores transcripcionales, Pho4p y Pho2p, son necesarios para generar la estructura de cromatina activa en el promotor de PHO5 y estimular la transcripción. Pho80p-Pho85p es un complejo cinasa dependiente de ciclina/ciclina que fosforila Pho4p en múltiples sitios para regular negativamente la función de Pho4p . Huang y O’Shea llevaron a cabo un cribado cuantitativo y enzimático de alto rendimiento de una colección de deleciones de levadura, buscando nuevos mutantes defectuosos en la expresión de PHO5. Entre los mutantes constitutivos, las cepas pho80 y pho85 mostraron los niveles más elevados de actividad fosfatásica de Pho5 y de ARNm de PHO5 en condiciones de alto nivel de fosfato, lo que concuerda con su papel central en la vía de PHO. La pérdida completa de la actividad quinasa alta (Pho80p-Pho85) resulta en la activación completa del factor de transcripción Pho4, lo que lleva a la expresión completa de PHO5.

Otra clase importante de fosfatasas en S. cerevisiae son las fosfatasas alcalinas (ALPasa; pH óptimo 8; EC 3.1.3.1). PHO8 codifica para una fosfatasa alcalina reprimible no específica (rALPasa). Es una glicoproteína localizada en la vacuola que escinde diversos sustratos para recuperar el fosfato de los productos intracelulares. Pho8p es una proteína dimérica dependiente de Mg2+/Zn2+, similar a la ALPasa de Escherichia coli y de las células de mamíferos . El producto enzimático de PHO13 es una proteína monomérica y es específica para el p-nitrofenil fosfato (pNPP) y el histidinil fosfato. Esta enzima fue fuertemente activada por iones Mg2+, con un pH óptimo de 8,2 y una alta actividad específica para el pNPP, con un valor medio de 3,6 × 10-5 M .

4. El estrés por fósforo modula las fosfatasas ácidas en las plantas

Las fosfatasas ácidas (APasas) pueden ser activas contra una amplia gama de fosfatos orgánicos presentes en el suelo. Estas enzimas son fosfohidrolasas ortofosfóricas inespecíficas (EC 3.1.3.2) que escinden el Pi de los sitios de enlace éster. Las fosfatasas vegetales secretadas mantienen una actividad del 50% en un amplio rango de pH (4,0-7,6), mantienen una actividad del 80% en un amplio rango de temperaturas (22°C-48°C) y son estables a temperaturas de hasta 60°C, lo que las convierte en candidatas ideales para ser enzimas activas del suelo .

Las apasas son abundantes en Arabidopsis y están representadas por al menos cuatro familias de genes. Un estudio reciente del genoma anotado de Arabidopsis identificó secuencias para 1 His APasa, 4 APasas fosfatídicas, 10 APasas de proteínas de almacenamiento vegetativo y 29 APasas púrpura.

En los últimos años, ha habido un considerable interés en las APasas púrpura (PAPs). El análisis comparativo de la estructura de las PAPs de plantas superiores y mamíferos ha permitido identificar la secuencia conservada y los motivos estructurales en este tipo de enzimas de muchas especies eucariotas .

Bioquímicamente, las PAP de plantas funcionan como proteínas homodiméricas con una masa molecular de ~55 kDa por monómero, mientras que las PAP de mamíferos son típicamente proteínas monoméricas con una masa molecular de ~35 kDa . Muchas PAP son glicoproteínas destinadas a la vía secretora. Se ha descubierto que una PAP de Spirodela oligorrhiza está anclada al glucosilfosfatidilinositol en la célula. Estructuralmente, las PAP vegetales tienen dos dominios. El dominio NH2 no tiene función catalítica. El dominio COOH tiene el centro metálico y es el dominio catalítico de la enzima. Otra PAP de Lupinus albus puede contener un tercer dominio, con una estructura parecida a la de las desaturasas de esteroles, en su extremo carboxilo. Se desconoce la frecuencia de estas dos últimas formas de modificación postraduccional en las PAP de otras especies. Las PAP son metaloenzimas que tienen un complejo binuclear de iones metálicos en su sitio activo. Su característico color rosa a púrpura se debe a una transición de transferencia de carga por un residuo de tirosina que coordina un ion férrico . Esta enzima puede hidrolizar ésteres y anhídridos del ácido fosfórico .

Las PAP se han aislado de Phaseolus vulgaris (judía común) , Glycine max (soja) , Lupinus albus (altramuz blanco) , Lycopersicon esculentum (tomate) , Triticum aestivum (trigo) , Hordeum vulgare (cebada) , Zea maize (maíz) y Oryza sativa (arroz) .

La respuesta de la planta a la falta de Pi puede dividirse en dos categorías: la respuesta específica y la respuesta general. Las respuestas específicas promueven la movilización y adquisición eficiente de Pi del medio de crecimiento y de las reservas intracelulares. Las respuestas generales permiten la supervivencia a largo plazo coordinando el metabolismo celular con la disponibilidad de nutrientes y el potencial de crecimiento . La aplicación de estas estrategias requiere cambios en los perfiles de expresión de cientos de genes, como demuestran los análisis del transcriptoma de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .

Durante la inanición de Pi, las plantas aumentan la expresión de fosfatasas como respuesta general . La producción de fosfatasas está vinculada a la deficiencia de Pi, y se ha propuesto una correlación positiva entre la producción de fosfatasas ácidas y la nutrición de Pi . Por ejemplo, plantas como los altramuces, que son más eficientes en la adquisición de Pi del suelo, producen significativamente más fosfatasa en comparación con los cereales .

Wu et al. analizaron la regulación de las proteínas fosfatasas en Arabidopsis y encontraron que tres genes para PAP fueron inducidos por la falta de Pi. Además, el gen At1g25230 fue inducido más de 2 veces, mostrando que este gen responde a la inanición de Pi.

En el genoma del arroz, se identificaron un total de 26 genes PAP putativos, y la inanición de Pi indujo la expresión de 10 genes PAP del arroz, lo que sugiere que éstos juegan un papel importante en la aclimatación del arroz a condiciones de bajo Pi.

En Lycopersicon esculentum (tomate), LePS2, es inducido por la inanición de Pi. Se observa que las fosfatasas LePS2 representan las primeras fosfatasas citoplasmáticas que son componentes de la respuesta a la inanición de Pi . La suspensión de las células de tomate en un medio carente de Pi condujo a un aumento de la actividad específica de PAP de aproximadamente 4 veces, pero la actividad específica de PAP permaneció baja y constante en las células mantenidas en un medio con alto contenido de Pi. El aumento de la actividad de PAP en el crecimiento de las células en medio carente de Pi demuestra que PAP podría tener un papel en la mejora de la disponibilidad y la utilización de Pi y puede ser fundamental para la movilización de Pi intracelular mediante la detección de la falta de Pi en el tomate .

5. Las ectofosfatasas como sensores de Pi

La membrana plasmática de las células puede contener enzimas cuyos sitios activos están orientados hacia el medio externo y no hacia el citoplasma. Las actividades de estas enzimas, denominadas ectoenzimas, pueden medirse utilizando células intactas . Se han detectado ectofosfatasas y ectoquinasas en varios microorganismos, incluyendo protozoos , bacterias y hongos .

Muchos estudios han demostrado el papel de las ectofosfatasas en la adquisición de Pi para su uso en el crecimiento de varios tipos de células . En las células de hongos (Fonsecae pedrosoi), el agotamiento de Pi del medio de cultivo aparentemente induce la expresión de diferentes actividades de ectofosfatasas . Se ha demostrado que el cultivo de estos hongos en ausencia de Pi exógeno da lugar a la generación de células fúngicas que expresan una actividad ectofosfatasa 130 veces superior a la expresada por los hongos cultivados en presencia de Pi . Las células de tripanosomas tienen ectofosfatasas que proporcionan Pi mediante la hidrólisis de metabolitos fosfomonoésteres . Por ejemplo, en T. rangeli, una baja concentración de Pi en el medio de crecimiento induce la expresión de una actividad ectofosfatasa diferente , lo que sugiere que esta enzima lleva a hidrolizar compuestos fosforilados presentes en el medio extracelular. Esta hidrólisis podría contribuir a la adquisición de Pi durante el desarrollo de los epimastigotes de T. rangeli .

En condiciones de limitación de Pi, las bacterias fluorescentes Pseudomona expresan un conjunto de genes de inanición de fosfato . Por ejemplo, se inducen al menos 56 proteínas de inanición de Pi en la cepa KT2442 de P. putida , y, en la cepa DF57 de P. fluorescens, se ha informado de la inducción de varios genes de inanición de fosfato .

En muchos eucariotas, la familia de proteínas de la pirofosfatasa/fosfodiesterasa de nucleótidos (E-NPP) es directamente responsable de la hidrólisis de fosfato a partir de nucleótidos extracelulares. Las NPP1 a -3 se encuentran en casi todos los tipos de tejidos humanos, y estas enzimas contienen un dominio alcalino de la ectonucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa tipo 1. En S. cerevisiae, NPP1 y NPP2 se regulan por medio de la transcripción regulada por Pi .

6. Observaciones finales

El Pi es un compuesto que limita el crecimiento en varios organismos cuando su disponibilidad es baja en muchos ecosistemas . La inducción de la actividad fosfatásica en respuesta a la falta de Pi es un fenómeno común entre los organismos que adquieren Pi del medio ambiente. Estas enzimas son capaces de hidrolizar sustratos fosforilados para suministrar una fuente de Pi durante una escasez de nutrientes. En Saccharomyces cerevisiae, la señal de falta de Pi desencadena una mayor producción de al menos cuatro tipos de fosfatasas: (1) las fosfatasas ácidas Pho5, Pho11 y Pho12, que se localizan en el espacio periplásmico; (2) la fosfatasa alcalina Pho8, que se localiza en la vacuola; (3) la fosfatasa de glicerol Hor2; (4) la putativa polifosfatasa Phm5, que se localiza en la vacuola. Todas estas enzimas pueden contribuir a aumentar los niveles de Pi libre. Sin embargo, podrían atribuirse otras funciones a estas enzimas.

Del Pozo et al. purificaron una fosfatasa ácida, AtACP5, que es inducida por la falta de Pi en Arabidopsis thaliana. Esta enzima presenta dos actividades, hidrólisis de sustratos fosforilados y formación de peróxido. La actividad fosfatasa probablemente refleja un papel en la movilización de Pi; la actividad de peroxidación sugiere que AtACP5 también podría desempeñar un papel en el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno.

En conjunto, las fosfatasas inducidas por la inanición de Pi desempeñan un papel en la adaptación de un organismo al estrés, aunque se pueden encontrar otras funciones.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero otorgado por el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), y la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick y A. L. A. Dos-Santos contribuyeron a partes iguales a este trabajo.