El 15 de febrero de 2010 (Vol. 30, No. 4)
Scott B. Mohler
Pasos sencillos para obtener imágenes de animales por bioluminiscencia con éxito
La luciferina es el sustrato básico de los ensayos de bioluminiscencia. Basada en una sencilla reacción en la que el ATP alimenta la catálisis de la luciferina de la luciérnaga (escarabajo) para producir luz, la bioluminiscencia tiene amplias aplicaciones. Su empleo como indicador de biomasa permite la detección de microorganismos en productos de consumo, superficies de plantas de fabricación, e incluso se ha utilizado para determinar si existe vida en la Luna y Marte.
La bioluminiscencia se está utilizando en la monitorización in vitro e in vivo de procesos biológicos, incluyendo la expresión de genes y las interacciones proteína-proteína. La luciferina se utiliza, por ejemplo, en ensayos de genes reporteros para estudiar la regulación y la función de los genes, en los que la expresión del reportero marcado con luciferina es un marcador que indica la captación satisfactoria del gen de interés en las técnicas de ADN recombinante. Como reactivo de detección, la reacción luciferina-luciferasa se utiliza en la pirosecuenciación para lograr una rápida detección de bases en los actuales sistemas de secuenciación de ADN de alto rendimiento.
Más recientemente, la obtención de imágenes de bioluminiscencia ha surgido como una poderosa técnica para el estudio directo de diferentes poblaciones celulares en animales pequeños vivos, como los ratones. En esta técnica, las células (por ejemplo, células cancerosas, células madre, células T) están diseñadas para expresar luciferasa e iluminarse. La visualización no invasiva en animales vivos mediante una cámara sensible de dispositivo de carga acoplada permite así observar en tiempo real la progresión y la regresión de la enfermedad en distintos momentos del curso del tratamiento terapéutico. Empleada para comprender las bases moleculares de patologías como los trastornos neurodegenerativos, los trastornos cardiovasculares, la obesidad y el cáncer, esta técnica es de inmenso valor para la clínica, el diagnóstico y el desarrollo de fármacos.
Los científicos de Regis Technologies han identificado puntos débiles comunes en los ensayos con luciferasa. Los problemas suelen producirse antes de que comience el ensayo. La luciferina de luciérnaga es una molécula sensible, e incluso los experimentos bien planificados pueden dar resultados erróneos si la luciferina se manipula mal y se daña antes de su uso. En este artículo, describimos la sal, la pureza, la manipulación y el almacenamiento óptimos de la luciferina para garantizar resultados satisfactorios y consistentes en la obtención de imágenes de animales y otros ensayos.
Consideraciones sobre la compra
Los investigadores a menudo se preguntan qué forma de luciferina deben utilizar. Las sales de potasio y de sodio de la luciferina suelen utilizarse indistintamente. Sin embargo, la disolución de la molécula es un factor importante a considerar para algunos ensayos. La sal de sodio es más soluble en agua (>100 mg/mL) que la de potasio (55 mg/mL). La forma libre de ácido, aunque todavía está disponible, no se utiliza a menudo debido a su dificultad de disolución.
Debido a que unas pocas impurezas pueden afectar a los experimentos de diferentes maneras, la pureza inicial del reactivo puede ser una consideración importante.
La luciferina, un enantiómero de la D-luciferina (Figura 1), es una impureza conocida en la luciferina sintética. Aunque se ha demostrado que funciona en las reacciones de luciferasa, es probable que se produzca un cambio significativo en el pico de emisión de luz dependiendo de los parámetros de recogida de datos utilizados. La L-luciferina se detecta y cuantifica fácilmente por HPLC quiral y debe figurar en el certificado de análisis del fabricante. La mayor parte de la luciferina debe contener menos del 0,5% de L-luciferina, aunque es probable que se puedan tolerar límites más altos siempre que los niveles de L-luciferina se mantengan constantes a lo largo del experimento.
La dehidroluciferina (Figura 1) es una impureza que actúa como inhibidor de la luciferasa, suprimiendo la altura del flash y la integración total. Una muestra dopada con un 1% de dehidroluciferina muestra menos de la mitad de la altura del destello y menos del 25% de la integración total durante 15 minutos. La dehidroluciferina puede formarse durante la síntesis o el almacenamiento de la luciferina. La selección de un fabricante que suministre niveles bajos de dehidroluciferina ayudará a garantizar resultados fiables y repetibles.
Muchas impurezas traza comunes de la síntesis de luciferina pueden inhibir otras enzimas en sistemas complejos y pueden causar variabilidad experimental debido a las diferencias entre lotes o entre fabricantes.
Figura 1. Comparación estructural de la D-luciferina y las impurezas
Almacenamiento
La luciferina de las moscas es sensible a la luz, el oxígeno y la humedad y debe protegerse. La luz y el oxígeno pueden catalizar la oxidación de la luciferina a dehidroluciferina. Si se deja en un frasco ámbar bajo nitrógeno a temperatura ambiente, la luciferina comenzará a descomponerse en dehidroluciferina al cabo de un mes (Figura 2), pero es estable en un frasco sin abrir durante al menos dos años en un congelador. Disuelta en agua con suficiente oxígeno, la luciferina se convertirá en deshidroluciferina en sólo unos días.
La luciferina debe comprarse y almacenarse en la menor cantidad posible para evitar la descomposición en deshidroluciferina por los múltiples ciclos de congelación-descongelación-apertura. Si se compra a granel, dividir el reactivo de luciferina en viales ámbar de un solo uso ayudará a garantizar la estabilidad. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo como solución congelada para aplicaciones sensibles como los estudios con animales enteros. Para ayudar a ralentizar la descomposición en las soluciones congeladas, rocíe la solución con nitrógeno o argón antes de congelarla.
Figura 2. Descomposición de la luciferina en dehidroluciferina en función del tiempo a 25ºC y -20ºC
Manejo
Cuando se abra el frasco de luciferina, debe dejarse que alcance la temperatura ambiente y purgarse con nitrógeno o argón antes de volver a cerrarlo. Si las soluciones de luciferina se van a utilizar en pocas horas, se necesitan pocas precauciones. Las soluciones que se van a utilizar durante un día deben purgarse con nitrógeno o argón. Las soluciones no deben utilizarse durante varios días, ya que se producirá la formación de deshidroluciferina.
Scott B. Mohler ([email protected]) es director de producto en Regis Technologies. Sitio web: www.registech.com.