Animales

Todos los ratones eran machos C57BL/6 de 3 a 11 meses de edad en el momento de las pruebas. Los ratones se compraron en los laboratorios Jackson, se alojaron en una instalación con temperatura (22 °C) y luz controladas, y se les dio libre acceso a comida y agua. Los ratones fueron eutanasiados mediante una sobredosis de isoflurano. Todos los procedimientos y el uso de los animales fueron aprobados por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Carolina del Este. El cuidado de los animales cumplió con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio, Comisión de Ciencias de la Vida, Consejo Nacional de Investigación (Washington: Prensa de la Academia Nacional, 1996).

Disección del FDB

Crítica para cualquier procedimiento que utilice el FDB es una disección cuidadosa que evite el daño al músculo (el músculo está rodeado por un área de tejido conectivo denso) (ver Fig. 1). Para facilitar la disección, se fijaron los dedos del pie a una tabla de corcho, asegurando el pie en su lugar con la planta del pie hacia arriba. A continuación, se pellizcó la piel del extremo proximal del pie (por encima del calcáneo) para que las microtijeras pudieran realizar incisiones a lo largo de los bordes laterales del pie hasta los dedos. Aún pellizcando la piel por encima del calcáneo, se utilizaron microtijeras para separar la piel de la musculatura subyacente. El colgajo de piel restante se peló y retiró para exponer la FDB y los tendones de los dedos. A continuación se cortó el tendón proximal y, mientras se sujetaba el tendón con unas pinzas, se cortó el FDB para separarlo de la fascia subyacente. A continuación se cortaron los tendones de los dedos para liberar el FDB del pie.

Aislamiento de miofibras

Después de la disección de la FDB, los músculos se colocaron en medios de cultivo frescos (DMEM con glutamina, FBS filtrado estéril al 2%, 0.1% de gentamicina) suplementado con 4 mg/ml de colagenasa A (Roche – 11088793001) durante 90-120 min a 37 °C en 5% de CO2 como se ha descrito previamente. El músculo FDB se colocó en 2 mL de medio de cultivo sin colagenasa y se trituró suavemente contra la pared del plato para liberar las fibras del haz utilizando el extremo cortado de una punta de pipeta P1000. Las miofibras aisladas se adhirieron a placas de fondo de cristal recubiertas con entactina-colágeno-laminina (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore). Las fibras se volvieron a colocar a 37 °C en un 5% de CO2 durante varias horas y posteriormente se obtuvieron imágenes como se describe a continuación.

Longitud de la fibra muscular FDB

Los músculos FDB de ratones C57BL/6 machos y hembras se ataron en el tendón proximal y en los tres tendones mediales de los dedos del pie con sutura de seda y se sujetaron a una pinza metálica para mantener la tensión en reposo. Las miofibras se aislaron como se ha descrito anteriormente, pero no se adhirieron a las placas de fondo de cristal. Las miofibras se fotografiaron utilizando un objetivo ×4 y un microscopio central EVOS XL y el software correspondiente (Life Technologies, Bothell, WA). Se midieron las longitudes de aproximadamente 1000 miofibras en ImageJ (versión 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). Cuando se aislaron, las miofibras ya no estaban en tensión y, por tanto, no representaban la longitud óptima. Para tener en cuenta este cambio en la longitud de las miofibras, se utilizó un factor de conversión utilizando la longitud del sarcómero, tal y como describió previamente el Dr. Richard Lieber. Cuando la longitud es óptima, se supone que la longitud óptima del sarcómero de una miofibra del músculo del ratón es de 2,5 μm de diámetro. Para normalizar las longitudes de las miofibras a la longitud del sarcómero, medimos la longitud del sarcómero en un subconjunto de 30 miofibras. Se midió la distancia entre 10 sarcómeros de cada miofibra y se calculó la longitud media del sarcómero en las 30 miofibras. La longitud óptima del sarcómero (2,5 μm) dividida por la longitud media medida del sarcómero produjo un factor de conversión de 1,14, que se utilizó para normalizar todas las longitudes medidas de las miofibras a la longitud óptima del sarcómero.

Tipo de fibra individual y tamaño de la fibra

El análisis del tipo de fibra muscular de la FDB se realizó en muestras de ratones C57BL/6, como se ha descrito previamente. Las secciones fueron probadas con anticuerpos primarios contra la cadena pesada de miosina tipo I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Banco de Hibridoma de Estudios de Desarrollo, Univ. de Iowa), y anti-distrofina (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), luego se obtuvieron imágenes usando un microscopio automático EVOS FL y el software que lo acompaña (Life Technologies, Bothell, WA). El tipo de fibra y el área de la sección transversal de la fibra (CSA) se evaluaron utilizando ImageJ, como se describió previamente.

Producción de fuerza isométrica

Se evaluó la producción de fuerza isométrica y la fatiga en los músculos EDL (n = 5), sóleo (n = 4) y FDB (n = 6) de ratones C57BL/6, como se describió previamente con ligeras modificaciones. Se expuso el FDB y se fijó el tendón proximal con sutura de seda. Se colocaron pinzas de punta fina debajo de los tres tendones mediales de los dedos del pie y se tiró suavemente hacia los dedos antes de asegurar los tres tendones (Fig. 1) con sutura de seda. Atamos los tres tendones mediales porque no es posible atar uno de los dedos debido a la ubicación anatómica, y atar el cuarto tendón no resulta, según nuestra experiencia, en una fuerza absoluta diferente (datos no mostrados). A continuación, se cortó cada tendón justo por encima del nudo y se levantó suavemente el FDB para separarlo del pie. Se utilizaron microtijeras para eliminar cualquier resto de tejido conectivo, liberándolo del pie. A continuación se ató el músculo a un transductor de fuerza y se suspendió en tampón Krebs Ringer oxigenado (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) a temperatura ambiente. A continuación, se ajustó la longitud del músculo hasta que la FDB produjo un pico de fuerza de contracción, momento en el que se fijó la tensión óptima de reposo (Lo) y se dejó que el músculo se equilibrara durante 10 minutos. Los músculos sóleos se prepararon atando un nudo cuadrado doble en el tendón distal del sóleo. El tendón se cortó por encima del nudo y los músculos posteriores se separaron suavemente de la pierna dejando al descubierto el tendón del sóleo proximal, que se ató con un nudo cuadrado doble. El EDL se disecó y se anudó como se ha descrito anteriormente. Los músculos del EDL y del sóleo se equilibraron en KRB oxigenada a temperatura ambiente a una tensión de reposo durante 10 minutos. Tras el equilibrio, se optimizó la tensión muscular mediante la realización de estímulos de contracción máximos y el ajuste de la longitud del músculo hasta alcanzar la fuerza máxima. Las estimulaciones de contracción se realizaron con un intervalo de 30 segundos para evitar la fatiga del músculo. A continuación, se estimularon los músculos con un intervalo de 60 s a 10, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 Hz para generar una curva de frecuencia de fuerza. Los músculos descansaron durante 1 minuto más antes de completar un protocolo de estimulación de 10 minutos para determinar la resistencia a la fatiga. El protocolo de fatiga estimuló los músculos a 30 Hz cada 2 s durante un periodo de 600 s para un total de 300 contracciones. Se registró la longitud óptima del músculo y se secó para eliminar el exceso de KRB antes de pesarlo. Se estableció un voltaje óptimo de 20 V antes de los experimentos para garantizar la estimulación máxima del FDB, el EDL y el sóleo (datos no mostrados). Los datos de la fuerza muscular absoluta se convirtieron en fuerza específica (N/cm2) utilizando ecuaciones previamente descritas para la estimación matemática del CSA del músculo y del área de la sección transversal fisiológica (PCSA). La principal diferencia entre el CSA y el PCSA es la inclusión de la relación entre la longitud de las fibras musculares y la longitud del músculo en la ecuación del PCSA. Utilizamos ambos métodos corregidos para proporcionar una mayor compatibilidad con la literatura.

Propiedades contráctiles pasivas

Las propiedades contráctiles pasivas se evaluaron en los músculos EDL y FDB de ratones macho C57BL/6 (n = 4), como se describió anteriormente , con ligeras modificaciones. Los músculos EDL y FDB se diseccionaron y se ataron a un transductor de fuerza como se ha descrito anteriormente. Los músculos se equilibraron durante 10 minutos en KRB oxigenado a temperatura ambiente. Tras el equilibrio, se optimizó la tensión muscular realizando estimulaciones de contracción máximas y ajustando la longitud del músculo hasta alcanzar la fuerza máxima. Las estimulaciones de contracción se realizaron con un intervalo de 30 segundos para evitar la fatiga del músculo. La longitud de referencia del músculo se midió como la Lo antes de someterse a un estiramiento pasivo de 105, 110, 115, 120, 125 y 130% de Lo. Los músculos se secaron para eliminar el exceso de KRB y luego se pesaron. Los datos se corrigieron con respecto a la CSA y la PCSA.

Lesión por cardiotoxina (CTX)

Se realizaron comparaciones en ratones C57BL/6 entre un FDB tratado con CTX (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) y un FDB contralateral tratado con PBS 4 días (n = 4) y 10 días después del tratamiento (n = 2). Se prepararon jeringas 31G estériles de 8 mm de longitud con 10 μL de 10 μM de CTX o 10 μL de 1× PBS estéril, como se ha descrito previamente. Tras la anestesia inducida por isoflurano, se limpió la base de los pies de cuatro ratones con toallitas de alcohol. Se inyectó CTX en la parte proximal del pie con la aguja colocada bajo la piel y hacia los dedos. Se inyectó PBS en el pie contralateral. Los ratones fueron sacrificados en el momento apropiado, y los FDB fueron disecados para la medición de la producción de fuerza, como se ha descrito anteriormente. Los datos se corrigieron a PCSA.

Tinción de hematoxilina y eosina

Los músculos FDB sometidos a 10 días de tratamiento con CTX se congelaron en una solución de temperatura óptima de corte (OCT) para su seccionamiento y tinción de H&E, como se ha descrito previamente .

Respirometría mitocondrial de alta resolución del músculo esquelético

Preparación de haces de fibras musculares permeabilizadas del gastrocnemio y del FDB

La respirometría se llevó a cabo en haces musculares permeabilizados aislados del gastrocnemio y del FDB extirpados de la misma extremidad de ratones C57BL/6 (n = 4). Se disecó una porción del gastrocnemio rojo y se utilizó para la preparación de haces de fibras permeabilizadas, como se ha descrito previamente. Se utilizó el músculo gastrocnemio rojo como tejido de comparación, ya que se suele utilizar para evaluar la respiración mitocondrial del músculo esquelético murino. El protocolo para preparar los haces de fibras musculares permeabilizados de los FDB se adaptó a partir de los métodos descritos anteriormente sobre la permeabilización de los haces de músculo gastrocnemio rojo y se describe a continuación. Los FDB se diseccionaron y se añadieron inmediatamente al tampón X helado (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazol, 20 taurina, 5,7 ATP, 14,3 fosfocreatina, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). Utilizando un microscopio de disección, se eliminaron cuidadosamente el tejido conectivo, la grasa y los vasos sanguíneos para evitar la pérdida de músculo. Los FDB se cortaron en haces y se dividieron en grupos de tres a cuatro haces de 1,5-2,0 mg de peso húmedo. A continuación, los grupos de haces se permeabilizaron en tampón X que contenía 22,5 μg/ml de saponina con rotación continua a 4 °C durante 5 minutos. Los haces musculares se transfirieron rápidamente al tampón Z frío (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) y se lavaron con rotación continua a 4 °C durante 15 min.

Respiración mitocondrial

Las mediciones del consumo de O2 de alta resolución se realizaron utilizando el OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) a 37 °C con una concentración inicial de oxígeno de ~ 300-350 μM como se ha descrito previamente . Los experimentos se realizaron en el tampón Z, que contenía 20 mM de creatina monohidratada y 25 μM de blebbistatina. La respiración mitocondrial se evaluó mediante la adición secuencial de sustratos a una concentración final de piruvato 4 mM, malato 0,5 mM, glutamato 5 mM, ADP 2.5 mM, succinato 5 mM, citocromo c 5 μM, rotenona 10 μM, antimicina A 5 μM, ácido ascórbico 2 mM y TMPD 0,5 mM (dihidrocloruro de N,N,N′-tetrametil-p-fenilendiamina). La integridad de la membrana mitocondrial se confirmó excluyendo los haces musculares gastrocnemios y los haces musculares FDB que produjeron un aumento > 10 o > 20% en la respiración, respectivamente, tras la adición de citocromo c exógeno. Se utilizó un criterio de exclusión diferente para los haces musculares del gastrocnemio y del FDB, ya que las pruebas preliminares indicaron que era común un mayor incremento porcentual de la respiración en los haces de fibras del FDB en comparación con los haces de fibras del gastrocnemio, tras la adición de citocromo c. Una vez finalizado el protocolo, los haces musculares se enjuagaron en H2O destilado, se liofilizaron (Labconco, Kansas City, MO) y se pesaron (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Las tasas de respiración de los haces musculares intactos de los gastrocnemios suelen corregirse en función del peso seco; sin embargo, debido a las diferencias en el contenido de tejido conectivo de los dos grupos musculares, los valores de JO2 también se corrigieron en función de la proteína total y la actividad de la citrato sintasa (CS). La actividad CS se midió utilizando el kit CS0720. Los productos químicos y los reactivos se adquirieron en Sigma Aldrich.

Microscopía

In vitro

Se aislaron fibras musculares FDB de ratones C57BL/6 y se fijaron en placas de fondo de cristal de 35 mm recubiertas con ECL, como se ha comentado anteriormente. Las miofibras aisladas se tiñeron con mitotracker deep red (M2246, Thermo Fisher) y NucBlue (R37605, Thermo Fisher) en DMEM durante 30 minutos. Las fibras se lavaron tres veces con 2 mL de KRB. Las fibras se fotografiaron utilizando un microscopio confocal de barrido láser de un solo fotón con un objetivo de inmersión en aceite de ×60 (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35) y la excitación se logró utilizando las líneas de 405 y 488 nm de un láser de argón multilínea.

In vivo

La generación de segundo armónico describe el efecto óptico producido por el paso de pulsos láser a través de materiales altamente polarizados y no centro-simétricos como la miosina. Cuando se polarizan a la longitud de onda adecuada, estos materiales emiten luz a la mitad de la longitud de onda de la que entra, produciendo imágenes de alta resolución sin necesidad de sondas fluorescentes que están sujetas a fotoblanqueo y fototoxicidad. Además, las longitudes de onda del infrarrojo cercano utilizadas permiten una penetración profunda en los tejidos sin necesidad de procedimientos invasivos. Los ratones C57BL/6 fueron anestesiados antes de que se les retirara la piel que cubre el FDB, exponiendo el músculo del FDB. Una vez expuesto, el FDB fue hidratado con KRB estéril y el ratón fue colocado en decúbito prono sobre un cubreobjetos de vidrio (#1.5, Leica), como se describió previamente (Fig. 1C). Las moléculas que contienen miosina y nicotinamida se excitaron a 900 y 720 nm utilizando un láser pulsado Ti:Sapphire de modo bloqueado (Mai Tai Deep See HP series, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), y la emisión se registró utilizando la detección no explorada con un filtro FV10 MRV/G ajustado a 450 y 420 nm, respectivamente. Todas las imágenes se tomaron con un objetivo de inmersión en aceite ×60 (Plan Apochromat, NA 1,35) y un LSM FV1000 de Olympus con el software de adquisición FV10-ASW 4.2.

Electroporación de ADNc y respirometría de alta resolución del músculo esquelético que sobreexpresa Pgc1α

La electroporación de ADNc en FDBs se realizó como se ha descrito previamente . Brevemente, las patas de siete ratones C57BL/6 machos y hembras anestesiados se limpiaron con una toallita con alcohol y las almohadillas de las patas se inyectaron con 10 μl de 2 mg/mL de hialuronidasa suspendida en KRB filtrada estérilmente utilizando una aguja estéril de calibre 31 de 8 mm de longitud. Aproximadamente 1 h después, los ratones fueron anestesiados por segunda vez. Los pies se limpiaron de nuevo con una toallita de alcohol y un pie recibió 30 μg de plásmido PGC1α marcado con proteína verde fluorescente (GFP) y el pie contralateral se inyectó con ADNc YFP. Tras una recuperación completa de la anestesia, los ratones fueron anestesiados por tercera vez ~ 10 min después. Se introdujeron electrodos de platino bajo la piel y se colocaron perpendiculares al FDB y paralelos entre sí en el talón y la almohadilla del pie bajo los dedos. La FDB se estimuló con 20 pulsos de 20 ms de duración a 1 Hz y 100 V . Los ratones fueron sacrificados 14 días después, y los FDB fueron disecados y visualizados bajo un microscopio fluorescente para confirmar la expresión del plásmido. A continuación, se prepararon muestras de músculo FDB intacto y se midió la respiración mitocondrial como se ha descrito anteriormente.

Estadísticas

Se evaluaron las distribuciones de los datos y los datos que no se ajustaban a una distribución normal se transformaron en base logarítmica 10. Los datos de frecuencia de fuerza contráctil se analizaron mediante ANOVA de dos vías con comparaciones múltiples de Tukey. La masa muscular, el tipo de fibra, el tiempo hasta la relajación máxima y media, y los datos de fatiga se analizaron mediante un ANOVA de una vía con comparaciones múltiples de Tukey. En los casos en que los datos no pudieron transformarse a una distribución normal, se realizó una prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn. Los ANOVAs se completaron utilizando GraphPad Prism 7.03. Los datos respiratorios y la actividad del CS se analizaron mediante pruebas t pareadas de dos colas con un nivel alfa de 0,05 utilizando Microsoft Excel. Todos los datos se presentan como media ± SEM.