Menschliche Teilnehmer

Die Experimente in Spanien wurden von der Ethikkommission des Universitätskrankenhauses La Fe Valencia geprüft und genehmigt und hielten sich an die Grundsätze der Deklaration von Helsinki und weitere Überprüfungen. Die Experimente in Berlin wurden von der Ethikkommission der Charité-Universitätsmedizin, Berlin, genehmigt (EA4/012/05). Es wurden zwei Kohorten untersucht: eine bestand aus 65 gesunden erwachsenen Freiwilligen und eine aus 16 Patienten mit Usher-Syndrom (Typ II), die verschiedene Trunkierungsmutationen in USH2A trugen. Die Daten von drei Patienten wurden in der vorliegenden Studie nicht berücksichtigt, da bei zwei Patienten zuvor Diabetes diagnostiziert worden war und ein Patient an einem Karpaltunnelsyndrom litt, das die psychophysischen Schwellenwerte beeinflussen könnte. Die Studienteilnehmer wurden mit einer Batterie von neun psychophysikalischen Tests getestet, die auf die Haut aufgetragen wurden. Alle Teilnehmer wurden vor der Teilnahme an der Studie schriftlich und mündlich aufgeklärt und gaben ihre schriftliche Einwilligung. Keiner der Studienteilnehmer war <20 Jahre alt. Die folgenden Teilnehmerinformationen wurden dokumentiert: Alter, Geschlecht, Händigkeit, Hörgeräte (Hörgeräte, Cochlea-Implantate), Schweregrad der Taubheits- und Blindheitssymptome und Komorbiditäten.

Quantitative sensorische Tests am Menschen

Die psychophysikalischen Tests wurden nach dem standardisierten Testprotokoll der quantitativen sensorischen Tests des Deutschen Forschungsnetzes für Neuropathischen Schmerz44 durchgeführt. Die vibrotaktilen Wahrnehmungsschwellen bei verschiedenen Frequenzen wurden mit Hilfe eines Zwei-Wahl-Tests bestimmt1,2. Das Gerät bestand aus einem linearen Piezoaktor (Physik Instrumente, Katalog-Nr. P-602.1 L), dessen Auslenkungen von einem Verstärker/Controller (Physik Instrumente, Katalog-Nr. E-665) gesteuert und kontrolliert werden. Die Signale wurden mit dem Datenerfassungssystem PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments) verarbeitet. Der Vibrationsreiz war 1,8 s lang, und die Anstiegs- und Abfallzeit am Anfang und Ende betrug 500 bzw. 600 ms, unabhängig von der Testfrequenz oder Amplitude. Die Dauer des Reizes zwischen der Einschalt- und der Ausschaltphase betrug 700 ms. Es wurde eine Reihe von Vibrationsreizen verwendet, die logarithmisch zwischen 18 nm und 45 μm skalierten. Für die 10-Hz- und 125-Hz-Vibrationstests wurde die Startamplitude auf 7,18 μm bzw. 2,84 μm festgelegt. Wir haben die Bewegung der Sonde unter den verwendeten Testbedingungen nicht direkt gemessen. Dieser Piezo-Aktuator weist eine hohe Genauigkeit auf, aber eine Amplitudendämpfung könnte theoretisch bei Auslenkungen mit größeren Amplituden in der Nähe der maximalen Wegamplitude des Aktuators (35 µm) auftreten. Alle Teilnehmer zeigten jedoch für alle getesteten Frequenzen psychophysikalische Schwellenwerte deutlich unter 35 µm (Abb. 1c). Es ist anzumerken, dass für die Messungen bei gesunden Kontrollpersonen und Teilnehmern mit Usher-Syndrom genau das gleiche Gerät verwendet wurde. Die mechanischen Vibrationsreize wurden auf die Haut zwischen dem Nagelbett und dem ersten Gelenk des kleinen Fingers übertragen. Die Sonde bestand aus Glas und hatte eine flache, kreisförmige Kontaktfläche von 5 mm Durchmesser mit einem Gegengewicht aus Messing, um sicherzustellen, dass bei jedem Teilnehmer der gleiche Grad an Haltekraft aufgebracht wurde. Der kleine Finger der dominanten Hand wurde bei zwei Frequenzen (10 Hz und 125 Hz; 1,8 s Dauer) getestet. Die Teilnehmer signalisierten die Erkennung eines Vibrationsreizes während eines von zwei Zeitfenstern durch Drücken eines Knopfes. Das Protokoll bestand aus einem Up-Down-Design, bei dem die Amplitude des Reizes (zwischen 18 nm und 45 µm) in Abhängigkeit von der Erfolgsquote während der Aufgabe erhöht oder verringert wurde. Acht Up-Down-Amplitudenumkehrungen (insgesamt ~40-80 einzelne Versuche pro Sitzung) um die Wahrnehmungsschwelle herum wurden durchgeführt, um eine mittlere Wahrnehmungsschwelle für jeden Patienten zu ermitteln. Die Amplitude der durch das Piezo-Gerät ausgelösten Vibrationsreize wurde kalibriert, indem die Auslenkungsamplitude der Sonde unter einem Mikroskop in Spannungsschritten gemessen wurde.

Ein Tastschärfetest wurde auch verwendet, um die Grenzen der räumlichen Auflösung der Fingerspitze (mediane Innervation) zu testen, wobei ein Zwei-Intervall-Forced-Choice-Test zur Orientierung des Tastgitters mit einem Tastschärfewürfel durchgeführt wurde, der aus sechs Seiten mit Gittern unterschiedlicher Breite bestand (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 und 6,0 mm)1,2,3. Den Teilnehmern wurden die Augen verbunden, und der Würfel wurde in vertikaler oder horizontaler Ausrichtung gegen ihre Fingerspitze gelegt. Es wurde ein „two-down“- und „one-up“-Verfahren mit 10-15 Wendepunkten der Gittergröße angewandt. Die Schwellenwerte (71% richtige Antwort) wurden als Median der letzten 10 von 15 Drehpunkten berechnet2. Die mechanischen Erkennungsschwellen wurden mit einem standardisierten Satz von 23 vFh-Filamenten (Optihair3-Set) mit Kräften zwischen 0,25 und 265 mN bestimmt. Die vFhs wurden in aufsteigender Reihenfolge auf der dorsalen Seite der Hand (radiale Innervation) für 1 s appliziert, bis der Teilnehmer eine taktile Empfindung wahrnahm. Die Reihenfolge wurde dann umgekehrt, bis der Teilnehmer keine taktile Empfindung mehr wahrnahm. Die mittlere Kraft von fünf Umkehrungen wurde als Schwelle genommen. Mechanische Schmerzschwellen wurden mit einem Satz von sieben gewichteten Nadelstichstimulatoren (MRC Systems) mit Spitzen von 0,25 mm und Kräften zwischen 8 und 512 mN getestet. Es wurde ein einfaches Treppenverfahren (Eins-auf- und Eins-ab-Regel) durchgeführt, bei dem die Patienten gefragt wurden, ob der Reiz als Schärfe wahrgenommen wurde, die das Gefühl eines stechenden Schmerzes verursachte. Die Reize wurden auf der Dorsalseite der Hand nach den vFh-Erkennungsaufgaben appliziert. Die Schwelle wurde aus dem Mittelwert von fünf Umkehrungen berechnet. Die Wahrnehmungsschwellen für Wärme und Kälte sowie die Schmerzschwellen für Wärme und Kälte wurden mit einem TSA II Thermosensory Analyzer (MEDOC) getestet. Die Thermode hatte eine Fläche von 9 cm2, Grenztemperaturen zwischen 0 und 50 °C und eine Temperaturänderungsrate von 1 °C s-1. Die Thermode wurde auf der volaren Seite der mittleren Unterarmregion (mediale antebrachiale Innervation) platziert. Für jeden thermischen Test wurden drei aufeinanderfolgende Versuche in der folgenden Reihenfolge durchgeführt: Kälteerkennung, Wärmeerkennung sowie Kälte- und Wärmeschmerzschwellen. Die Studienteilnehmer wurden gebeten anzugeben, ab welchem Punkt sie Abkühlung, Erwärmung, Kälte- und Hitzeschmerz empfanden. Die Schwellenwerte waren die durchschnittliche Temperatur der drei Versuche in jedem Test.

Mäuse

Alle Experimente wurden von der Berliner Tierethikkommission (Landesamt für Gesundheit und Soziales) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem europäischen Tierschutzrecht durchgeführt. Es wurden männliche und weibliche Ush2a-/- Mäuse und Wildtyp-Wurfgeschwister (Ush2a+/+) vom CBA/CaJ-Hintergrund im Alter zwischen 10 und 30 Wochen verwendet11. Alle anatomischen und elektrophysiologischen Experimente wurden an einer ungefähr gleichen Anzahl von weiblichen und männlichen Mäusen durchgeführt. Für die Aufgabe der Vibrationserkennung wurden nur weibliche Mäuse verwendet. Alle Mäuse wurden in einem 12-Stunden-Licht:12-Stunden-Dunkel-Zyklus gehalten.

Gewebeanatomie der Maus und Immunhistochemie

Für die Immunhistochemie der Haut wurden die Mäuse durch CO2-Inhalation für 2-4 Minuten euthanasiert, gefolgt von einer zervikalen Dislokation, und das Hautgewebe der Pfoten wurde seziert und die Unterhaut, die Bänder und das anhängende Muskelgewebe entfernt. Die Hautproben wurden mit Insektennadeln gestreckt und 45 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Für Gelatine-Vibratomschnitte wurden die Gewebeproben in Einbettformen (Polysciences, T-8) gelegt, mit warmer Gelatine (20 %, gelöst in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) gefüllt und über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA fixiert, bevor mit einem Vibratom (Leica, VT100S) 120-µm-Schnitte geschnitten wurden. Für die Ganzkörperfärbung wurden die Hautproben 2 Stunden lang in PFA gedehnt und dann 24 Stunden lang bei 4 °C in 20 % Dimethylsulfoxid und 80 % Methanol nachfixiert. Nach dem Schneiden oder Nachfixieren wurden die Gewebeproben dreimal in PBS (0,1 M) gewaschen und 72 Stunden lang bei 4 °C in Blockierlösung und primären Antikörpern inkubiert. Anschließend wurden die Proben dreimal in PBS gewaschen, bevor sie 24 Stunden (4 °C) mit in Blockierungslösung verdünnten sekundären Antikörpern inkubiert wurden. Anschließend wurde das Gewebe erneut dreimal gewaschen und mit 2,2′-Thiodiethanol (TDE, Sigma-Aldrich) geklärt. Die Schnitte wurden alle 2 Stunden in ansteigende Konzentrationen von TDE (10 %, 25 %, 50 % und 97 %) gelegt, in denen die Proben gelagert und auf Objektträger und Deckgläser aufgezogen wurden.

Polyklonale Antikörper gegen Ush2A wurden von Eurogentec für Kaninchen entwickelt. Es wurden vier Antikörper hergestellt, die an unterschiedliche Bindungsepitope am N- und C-Terminus von Ush2A binden (N-Terminus: Antikörper 1, CSPLYNDKPFRSGDNV und Antikörper 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-Terminus: Antikörper 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR und Antikörper 2, CIRERPPLVPLQKRMT) und vor der Verwendung aus Antiseren gereinigt wurden. Alle vier Antikörper wurden zusammen (1:200) für Färbeprotokolle in aufeinander folgenden Färbungen mit Hühner-Anti-NF200 (Millipore, 1:1.000), Kaninchen-Anti-S100 (Dako, 1:1.000) oder Meerschweinchen-Anti-CK20 (Origene Tech, 1:200) verwendet. Als sekundäre Antikörper wurden Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), Anti-Huhn-Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800), Anti-Maus-Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) und Anti-Meerschweinchen-Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) verwendet. Z-Stapel-Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Carl-Zeiss, Katalognummer LSM700) und der Zen2009-Software aufgenommen. NF200+ und S100+ Nervenfasern, die Meissner-Körperchen und Haarfollikel versorgen, wurden mit Fiji/ImageJ sichtbar gemacht und gezählt. Für elektronenmikroskopische Aufnahmen des Ischiasnervs wurden die Tiere perfundiert, der Ischiasnerv herausgeschnitten, in 4 % PFA und 2,5 % Glutaraldehyd fixiert und mit Osmiumtetroxid kontrastiert, bevor er in Technovit 7100 Harz (Heraeus Kulzer) eingebettet wurde. Die ultradünnen Schnitte wurden bei 5.600facher Vergrößerung aufgenommen. Myelinisierte Nervenfasern und nicht myelinisierte Fasern wurden mit der Software Fiji/ImageJ gezählt und gemessen.

Reproduzierbarkeit

Alle immunhistochemischen Experimente und aufgenommenen Bilder wurden in mehreren Mäusekohorten an verschiedenen Tagen wiederholt, und es wurden keine Bilder von einzelnen Individuen genommen, die nicht reproduziert werden konnten. Elektronenmikroskopische Bilder wurden von verschiedenen Wurfgeschwistern in einem einzigen Versuchsdurchgang aufgenommen.

Maus-Hautnervenpräparat und sensorische afferente Aufzeichnungen

Aufzeichnungen von kutanen sensorischen Fasern wurden unter Verwendung des Ex-vivo-Hautnervenpräparats durchgeführt. Die Mäuse wurden durch CO2-Inhalation für 2-4 Minuten euthanasiert, gefolgt von einer zervikalen Dislokation. Drei verschiedene Präparate wurden in separaten Experimenten mit unterschiedlichen Pfotenregionen durchgeführt: der Nervus saphenus, der die behaarte Haut der Hinterpfote innerviert21, der Nervus tibialis, der die kahle Haut der Hinterpfote innerviert, und der Nervus medialis und Nervus ulnaris, der die kahle Haut der Vorderpfote innerviert20. Bei allen Präparaten wurde die behaarte Haut der Gliedmaße rasiert und die Haut und der Nerv freipräpariert und in die Aufzeichnungskammer gebracht, wo Muskel-, Knochen- und Sehnengewebe von der Haut entfernt wurden, um die Aufzeichnungsqualität zu verbessern. Die Aufzeichnungskammer wurde bei 32 °C mit einer synthetischen interstitiellen Flüssigkeit perfundiert: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM Natriumgluconat, 5,5 mM Glukose, 7,5 mM Saccharose und 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure (Hepes), pH 7,4. Die Haut wurde abgesteckt und gedehnt, so dass die Außenseite der Haut mit Stimulatorsonden stimuliert werden konnte. Der periphere Nerv wurde in eine angrenzende Kammer in Mineralöl geleitet, wo feine Fäden vom Nerv abgezogen und auf einer Silberdraht-Aufzeichnungselektrode platziert wurden.

Die rezeptiven Felder der einzelnen Mechanorezeptoren wurden durch mechanisches Abtasten der Hautoberfläche mit einem stumpfen Glasstab oder einer stumpfen Pinzette identifiziert. Das analoge Ausgangssignal eines Neurolog-Verstärkers wurde gefiltert und mit dem Powerlab 4/30-System und der Labchart 7.1-Software (ADinstruments) digitalisiert. Die Spike-Histogramm-Erweiterung für Labchart 7.1 wurde verwendet, um die Spikes der einzelnen Einheiten zu sortieren. Elektrische Stimuli (1 Hz, quadratische Impulse von 50-500 ms) wurden an die rezeptiven Felder einzelner Einheiten abgegeben, um die Leitungsgeschwindigkeit zu messen und eine Klassifizierung als C-Fasern (Geschwindigkeit <1,2 m s-1), Aδ-Fasern (1,2-10 m s-1) oder Aβ-Fasern (>10 m s-1) zu ermöglichen. Die mechanische Stimulation der rezeptiven Felder der Neuronen erfolgte mit einem Piezoaktor (Physik Instrumente, Katalognummer P-841.60) und einem doppelendigen Nanomotor (Kleindiek Nanotechnik, Katalognummer MM-NM3108), der mit einem Kraftmessgerät (Kleindiek Nanotechnik, Katalognummer PL-FMS-LS) verbunden war. Kalibrierte Kraftmessungen wurden gleichzeitig mit dem Powerlab-System und der Labchart-Software während des Experiments erfasst (Erweiterte Daten, Abb. 10).

Da verschiedene Fasertypen unterschiedliche Reizabstimmungseigenschaften haben, wurden je nach Einheitstyp unterschiedliche Protokolle für mechanische Reize verwendet. Niedrigschwellige Aβ-Fasern (RAMs und SAMs) und Aδ-Faser-D-Haare wurden mit dem Piezo-Aktor mit drei Vibrationsreizen (5 Hz, 25 Hz und 50 Hz, Verzerrungen durch den serieninternen Kraftsensor schlossen die Verwendung von Frequenzen >50 Hz aus) mit zunehmender Amplitude über sechs Stufen (Spitze-Spitze-Amplituden von ~6-65 mN) stimuliert; 20 Zyklen pro Schritt) und eine dynamische Stimulussequenz mit vier Rampen- und Haltewellenformen mit unterschiedlichen Auslenkgeschwindigkeiten der Sonde (3 s Dauer; 0.075, 0,15, 0,45 und 1,5 mm s-1; durchschnittliche Amplitude 100 mN). Aβ-Faser-SAMs und -RAMs wurden anhand des Vorhandenseins bzw. Nichtvorhandenseins von Feuern während der statischen Phase eines Rampen- und Haltestimulus klassifiziert, wie zuvor beschrieben20,21. Einzelne Einheiten wurden zusätzlich mit einer Serie von fünf statischen mechanischen Reizen mit Ramp-and-Hold-Wellenformen zunehmender Amplitude (3 s Dauer; von ~10 mN bis 260 mN) stimuliert. SAMs mit niedrigem Schwellenwert, Aδ-Fasern mit hohem Schwellenwert und C-Fasern wurden ebenfalls mit dem Nanomotor mit fünf Rampen- und Halteimpulsen mit ansteigender Amplitude stimuliert20.

Einzelaufzeichnungen von Pacinischen Afferenzen

Um die Mechanosensitivität der Pacinischen Korpuskeln um die Fibula zu beurteilen, wurden die Haut und alle Muskeln vom Unterschenkel entfernt und der Nervus interosus von der Membrana interossea freipräpariert. Anschließend wurden Fibula und Tibia, die bei Mäusen entlang ihrer distalen Hälfte miteinander verwachsen sind, zusammen mit dem Nervus interosus aus dem Tier entfernt und in eine speziell angefertigte Organbadkammer gebracht, wo sie mit einem speziell angefertigten Mini-Bohrstock befestigt wurden. Das gesamte Präparationsverfahren wurde in eiskaltem Präparationspuffer durchgeführt, der 108 mM N-Methyl-d-Glucamin, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM Natriumgluconat, 5,5 mM Glucose, 18,5 mM Saccharose und 0,5 mM CaCl2 (mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt) enthielt. Nach einer Erholungsphase von 10 Minuten wurde das Präparat mit sauerstoffhaltigem Aufnahmepuffer (35 °C) perfundiert, der aus 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM Natriumgluconat, 5,5 mM Glucose, 7,5 mM Saccharose und 1,5 mM CaCl2 (mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt), und das proximale Ende des Nervus interosus wurde in eine mit Öl gefüllte Aufzeichnungskammer überführt, indem es durch ein kleines Loch (~1 mm Durchmesser), das die Organbadkammer mit der angrenzenden Aufzeichnungskammer verband, eingeführt wurde. Nach Entfernung des Perineuriums wurden einzelne Filamente herausgeschnitten und an der Aufzeichnungselektrode für die Aufzeichnung des Aktionspotenzials befestigt. Die Aufzeichnungen erfolgten mit dem Neurolog-System (Digitimer Ltd, Katalognummern NL100AK und NL104A) und einem PowerLab 4SP, das von LabChart 7.1 (AD Instruments) gesteuert wurde. Zur Bestimmung der mechanischen Aktivierungsschwelle und der Frequenzabstimmung der Pacinischen Afferenzen wurde eine Serie sinusförmiger mechanischer Reize (Dauer 1 s; linear ansteigende Amplitude damp/dt = 30 µm s-1; maximale Amplitude 30 µm) mit ansteigenden Frequenzen (40-480 Hz) auf das distale Ende der Fibula mit einem Metallstab (Spitzendurchmesser 1 mm) appliziert, der an einem Piezo-Aktor (Physik Instrumente GmbH, Katalognr. P-840.2) angebracht.

Lernaufgabe zur Vibrationswahrnehmung bei Mäusen

Zur Implantation der Kopfstütze wurden die Mäuse zunächst mit Isofluran (1,5-2% in O2) betäubt und subkutan mit Metamizol (200 mg pro kg Körpergewicht) injiziert. Eine Leichtmetallstütze wurde mit Kleber (UHU dent) und Zahnzement (Paladur) auf den Schädel implantiert. Die Temperatur der Mäuse wurde mit einer Rektalsonde überwacht und mit Hilfe eines Heizkissens auf 37 °C gehalten. Die Mäuse wurden dann in ihren Heimkäfig gesetzt und erhielten Metamizol (200 mg ml-1) im Trinkwasser. Die implantierten Mäuse wurden 3-5 Tage nach der Operation an die Kopfhaltung gewöhnt. Die Mäuse wurden allmählich an die Fixierung des Kopfes in der Versuchsanordnung gewöhnt. 1 Tag nach Beginn der Wasserrestriktion wurden die Mäuse an aufeinanderfolgenden Tagen zwei Paarungssitzungen unterzogen.

Während der Paarungssitzungen (30- bis 45-minütige Dauer) wurden Wasserbelohnungen aus einem Wasserauslauf gegeben, gepaart mit der Präsentation des Vibrationsreizes (3 s Dauer, 5 Hz, 60 mN) auf der kahlen Haut der Vorderpfote, um eine Assoziation zwischen Reiz und Belohnung herzustellen. Der Vibrationsreiz wurde über einen speziell angefertigten, 2 mm2 großen gepolsterten Glasstab, der an einem Piezoaktor (PICMA von Physik Instrumente, Katalognummer PL127.11) befestigt war, auf die Pfote übertragen. Zur Kalibrierung des Spannungskraftverhältnisses wurde ein Kraftmesssystem (Dual-Mode Lever Arm System 300-C, Aurora Scientific) verwendet, um das vom Piezoaktor nach jedem Experiment aufgebrachte sinusförmige Kraftprofil zu messen. Der verwendete Biege-Piezoaktor könnte im Vergleich zu anderen gestapelten Piezosystemen ein gewisses harmonisches Rauschen verursacht haben. Die Kalibrierung des Piezos in jedem Experiment stellte jedoch sicher, dass die erheblichen Defizite in der taktilen Wahrnehmung der Ush2a-defizienten Mäuse wahrscheinlich kein technisches Artefakt waren.

Nach der Paarung begannen tägliche Trainingssitzungen, bei denen die Mäuse eine kleine Wasserbelohnung (4-7 μl) aus der Tülle erhielten, wenn sie während eines Zeitfensters zu Beginn des Reizes (3,5 s) korrekt leckten. Auffangversuche, bei denen kein Stimulus präsentiert wurde und Lecken als Fehlalarm gewertet wurde, wurden zu 50 % in die Gesamtversuche eingeschlossen. Die Versuche wurden nicht durch ein externes Ereignis oder einen Reiz ausgelöst, wie zuvor beschrieben10 , und erfolgten in zufälligen Zeitintervallen zwischen 3 und 30 s. Wenn die Mäuse während eines 2-s-Fensters vor Beginn des Reizes leckten, wurde eine Verzögerung von 3 bis 30 s eingeführt, um die Assoziation zwischen Reiz und Wasserbelohnung zu fördern. Eine Trainingssitzung bestand aus etwa 60 Versuchen (30× Stimulus + 30× Fang). Die Treffer- und Fehlalarmraten wurden verglichen, um die Leistung während der Trainingssitzungen zu bewerten. Um zu prüfen, ob die Mäuse als Reaktion auf den Vibrationsreiz an der Vorderpfote lecken, wurde am Ende des Trainings eine Sitzung durchgeführt, bei der das Stimulationsgerät 3-5 mm unter die Pfote bewegt wurde, so dass kein Hautkontakt entstand. An den folgenden Versuchstagen, nachdem die Mäuse die Aufgabe erfolgreich gelernt hatten, wurden Vibrationsreize mit unterschiedlichen Amplituden und Frequenzen gegeben. Bei der 5-Hz-Vibration wurde die Vorderpfote mit Kräften von 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN und 6 mN stimuliert, wobei sich an jedem Tag zwei verschiedene Amplituden mit Fangversuchen abwechselten. So wurden z. B. 48-mN- und 24-mN-Stimuli und Fangversuche während einer Sitzung mit etwa 100 Versuchen (33× 48-mN-Stimulus + 33× 24-mN-Stimulus + 34× Fangversuche) ineinander verschachtelt. Die 6-mN-Stimuli wurden in zwei Sitzungen getestet. Bei den 25-Hz- und 125-Hz-Vibrationen wurden 60-mN- und 12-mN-Kräfte derselben Frequenz in gleicher Weise über zwei Testsitzungen mit Fangversuchen verschachtelt.

Mausverhaltenstest mit gepaarter Impulshemmung

Die Schreckreaktion von Mäusen wurde mit dem Startle Response System (SR-LAB, San Diego Instruments) untersucht. Die Mäuse wurden vor dem Test 3 Tage lang täglich 30 Minuten lang an das Gerät gewöhnt. Die Schreckreaktionen der Mäuse wurden in insgesamt 48 Versuchen mit alleinigem Impuls45 (40 ms Dauer, 129 dB) und Versuchen mit Vorimpuls und Impuls (20 ms Vorimpuls von 69, 73 oder 81 dB) gemessen. Die Vorimpulsversuche fanden 200 ms vor den Impulsversuchen statt. Der Prozentsatz der Hemmung durch gepaarte Impulse (% PPI) für jede Vorimpulsintensität wurde berechnet als %PPI = 100 × ((Impuls allein) – (Vorimpuls + Impuls))/Impuls allein.

Verhaltensversuche mit Mäusen vFh und Bürsten

Mäuse wurden 3 Tage vor den Tests täglich 30 Minuten lang an die Testumgebung gewöhnt. An den Versuchstagen wurden die Mäuse in einzelnen Plexiglas-Kabinen auf einer erhöhten Gitterplattform untergebracht. Für den Bürstentest wurde die linke Hinterpfote in zufälligen Abständen 10-mal mit einem 2-mm-Pinselkopf von der Ferse bis zu den Zehen gestrichen. Der Prozentsatz der Rückzüge wurde berechnet. An den folgenden Versuchstagen wurden die Schwellenwerte für den mechanischen Reizentzug mit vFhs gemessen. Dazu wurden die Plantarflächen der linken Hinterpfote mit vFh-Fäden stimuliert und die Reflexschwelle mit Hilfe der Up-Down-Methode46 bestimmt. Je nach Reaktion des Tieres wurden vFhs mit höherer oder niedrigerer Kraft auf die Hinterpfote appliziert, um eine Serie von sechs bis neun positiven oder negativen Reflexauslösungen zu erzeugen. Dieses Reaktionsmuster wurde dann so umgewandelt, dass die Daten als Logarithmus des Mittelwerts der 50%igen Reflexentzugsschwelle ausgedrückt werden46.

Datenanalyse der menschlichen Psychophysikdaten

Die Daten wurden auf Normalität getestet, und die Unterschiede in der psychophysischen Leistung für jeden Test zwischen Kontrollteilnehmern und Patienten mit Usher-Syndrom wurden mit ungepaarten Student’s t-Tests oder Mann-Whitney-U-Tests verglichen. Die z-Transformationen wurden verwendet, um einzelne individuelle Datenprofile mit dem Mittelwert und der Standardabweichung der gesunden Kontrollgruppe zu vergleichen. Der z-Score wurde mit Hilfe von Excel-Tabellen auf der Grundlage der Formel z = (Patientenwert – Gruppenmittelwert pro s.d. des Gruppenmittelwerts) berechnet. Die z-Werte >0 zeigen einen Funktionsgewinn an, was bedeutet, dass der Teilnehmer im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen empfindlicher auf die getesteten Reize reagiert. Einzelne z-Werte, die außerhalb des 95%-Konfidenzintervalls (d.h. z-Wert <1,96 oder >1,96 s.d.) des Datensatzes der gesunden Kontrollen liegen, können identifiziert werden. Die Leistung in jedem Test wurde in paarweisen Vergleichen mit dem Mann-Whitney U-Test getestet, und wir betrachteten P < 0,01 als statistisch signifikant.

Datenanalyse des Vibrationsverhaltens der Mäuse

Treffer wurden mit einem Sensor an der Spitze des Wasserbelohnungsauslaufs aufgezeichnet. Bei Stimulusversuchen wurde ein Treffer gezählt, wenn innerhalb des Zeitfensters (3,5 s) nach Beginn des Stimulus ein Lecken stattfand. Die Verhaltensdaten wurden mit Hilfe angepasster Routinen in Lab View mit einer Abtastrate von 1 kHz erfasst, und für die Analyse wurden angepasste Python-Skripte verwendet. Während der Fangversuche wurde ein falscher Alarm ausgelöst, wenn während eines gleich langen Zeitfensters ein Lecken auftrat. Um zu beurteilen, ob die Mäuse die Erkennungsaufgabe erfolgreich erlernt haben, wurden die Trefferquoten mit den Falschalarmquoten innerhalb derselben Trainingssitzung verglichen, wobei eine zweifache Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (ANOVA) mit Bonferroni-Post-hoc-Tests durchgeführt wurde.

Um die Leistung bei den Erkennungsaufgaben zu quantifizieren, verwendeten wir d‘ (Sensitivitätsindex) anstelle des Prozentsatzes der korrekten Versuche, um die Verzerrung bei den Leckkriterien zu berücksichtigen47. Zur Berechnung von d‘ wurde die folgende Formel verwendet: d‘ = z(h) – z(fa), wobei z(h) und z(fa) die normale Umkehrung der kumulativen Verteilungsfunktion der Treffer- bzw. Fehlalarmraten sind. Um unendliche d‘-Werte zu vermeiden, wenn alle Versuche gemeldet wurden (Rate = 1) oder keiner (Rate = 0), wurden die Raten durch (1½N) bzw. (½ N) ersetzt, wobei N die Anzahl der Versuche ist, bei denen der Stimulus präsentiert wurde48. Die z-Scores für Treffer- und Fehlalarmraten wurden mit OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) mit der Funktion NORMINV berechnet. Wir haben statistische Tests nur für Daten durchgeführt, bei denen mindestens einer der Genotypen d‘ > 1,0 aufweist, was bedeutet, dass diese Mäuse den Reiz gemeldet haben. Die Verhaltensdaten wurden mit angepassten Routinen in Lab View mit einer Abtastrate von 1 kHz erfasst, und für die Analyse wurden angepasste Python-Skripte verwendet. Die angepassten Codes und Skripte sind auf Anfrage erhältlich; weitere Informationen finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die diesem Manuskript beigefügt ist.

Das Leckverhalten wurde berechnet und als Leckwahrscheinlichkeit, erste Leckfrequenz (Hz) oder mittlere erste Lecklatenz (s) dargestellt. Diese Maße wurden wie folgt berechnet: Die Leckwahrscheinlichkeit ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Maus während des Gelegenheitsfensters in einem Stimulus- oder Fangversuch mindestens einmal leckt (Versuche mit mindestens einem Leckvorgang/gesamte Versuche). In den PSTHs des ersten Leckens zeigen wir die gebinnte Verteilung der Latenzen des ersten Leckens in Stimulus- oder Fangversuchen. Um diese Daten für alle Mäuse zu normalisieren, haben wir die Anzahl der ersten Licks durch die Gesamtzahl der Versuche geteilt. Durch Division des Wertes des ersten Leckens durch die Bin-Breite wurde der Wert in Hertz (Lecken pro s) berechnet. Die mittlere Latenzzeit des ersten Leckens (s) wurde berechnet, indem die Latenzen des ersten Leckens in jedem Versuch addiert und durch die Gesamtzahl der Versuche geteilt wurden.

Datenanalyse der Aufzeichnungen von Hautnervenpräparaten

Kutane Vorder- und Hinterpfoteneinheiten wurden auf der Grundlage ihrer Leitungsgeschwindigkeit und ihrer Reaktionen auf mechanische Reize kategorisiert. Die mechanischen Schwellenwerte der Einheiten wurden als die Temperatur oder die mechanische Amplitude berechnet, die erforderlich ist, um das erste Aktionspotenzial auszulösen. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 6.0 und Python durchgeführt. Zu den statistischen Tests gehören zweifache ANOVAs mit wiederholten Messungen und Bonferronis Post-hoc-Test, Student’s t-Tests, Mann-Whitney U-Tests und Wilcoxon’s Matched-Pair-Tests. Kolmogorov-Smirnov-Tests wurden verwendet, um die Normalität der Daten zu bewerten. Die Sternchen in den Abbildungen zeigen die statistische Signifikanz an: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Datenanalyse der Elektronenmikroskopie von Mausnerven

Für die Analyse der elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Maus-Ischiasnerven wurde die Anzahl der myelinisierten und nicht myelinisierten Fasern in 12 Schnitten pro Nerv gezählt. Die Gesamtzahl der Fasern pro Nerv wurde dann aus der Querschnittsfläche jedes Nervs extrapoliert.

Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.