Abstract

Zellen sind in der Regel von der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben, und die Adhäsion der Zellen an die ECM ist ein wichtiger Schritt bei ihrer Wanderung durch Gewebe. Integrine sind wichtige Rezeptoren für die ECM und bilden Strukturen, die als fokale Adhäsionen (FAs) bezeichnet werden. Die Bildung und Auflösung von FAs wird während der Zellwanderung dynamisch reguliert. Die Adhäsion an die ECM wurde hauptsächlich anhand von Zellen untersucht, die auf einem ECM-beschichteten Substrat kultiviert wurden, wobei die Geschwindigkeit der Zellmigration durch den Umsatz der FAs bestimmt wird. Die molekularen Vorgänge, die dem Abbau der FAs zugrunde liegen, sind jedoch weniger gut verstanden. Wir haben kürzlich sowohl einen neuen Regulator dieses Abbauprozesses als auch dessen Interaktionspartner identifiziert. Hier fassen wir unser Verständnis des FA-Abbaus zusammen, indem wir uns auf die Proteine konzentrieren, die an diesem Prozess beteiligt sind.

1. Einleitung

Die Adhäsion von Zellen an die ECM ist entscheidend für die Regulierung von Zellmorphologie, Migration, Proliferation, Überleben und Differenzierung. Diese Funktionen sind während der Entwicklung und für die Aufrechterhaltung der Gewebestruktur und die Einleitung der Gewebereparatur unerlässlich. Integrine sind die vorherrschenden Rezeptoren, die die Zelladhäsion an Komponenten der ECM vermitteln. Integrine werden auf der Zelloberfläche als Heterodimere exprimiert, die aus nicht kovalent verbundenen α- und β-Untereinheiten bestehen. Beide Untereinheiten sind Transmembranproteine vom Typ I, die sowohl eine große extrazelluläre Domäne, die für die Bindung an ECM-Liganden verantwortlich ist, als auch einen zytoplasmatischen Teil (CP) enthalten, der mehrere intrazelluläre Proteine rekrutiert. Bei Säugetieren sind achtzehn verschiedene α- und 8 β-Untereinheiten charakterisiert worden, und bisher wurden 24 verschiedene Integrin-Heterodimere identifiziert. Jedes Integrin erkennt einen bestimmten ECM-Liganden. Das Repertoire an Integrinen, die auf der Oberfläche einer bestimmten Zelle exprimiert werden, fungiert somit als Sensor für die ECM-Umgebung.

Die Anheftung von Zellen an ECM-Komponenten führt zu einer Anhäufung von Integrinen auf der Zelloberfläche. Die zytoplasmatischen Teile der gebündelten Integrine dienen dann als Plattform für die Rekrutierung von zellulären Proteinen wie Adaptor-/Gerüstproteinen und Signalproteinen an der inneren Oberfläche der Plasmamembran, wo sie Strukturen bilden, die als fokale Adhäsionen (FAs) bezeichnet werden (Abbildung 1). Die Adaptor-/Scaffold-Proteine in FAs, wie Talin, Paxillin, Tensin, p130Cas und α-Actinin, stellen starke Verbindungen zum Aktin-Zytoskelett her und verbinden die Zellen dadurch fest mit der ECM. Diese Verknüpfung ermöglicht die Erzeugung der Spannung, die zur Veränderung der Zellmorphologie erforderlich ist, und der Zugkraft, die zur Bewegung des Zellkörpers während der Migration notwendig ist. Darüber hinaus werden mehrere Signalproteine, darunter Kinasen und Phosphatasen, an die FAs gebunden, wo sie von der ECM stammende Signale an zelluläre Signalwege weiterleiten, die Proliferation, Überleben und Migration steuern. Insbesondere zwei gut charakterisierte Tyrosinkinasen, die fokale Adhäsionskinase (FAK) und Src, spielen in Integrin-vermittelten Signalkaskaden eine zentrale Rolle. Da Integrine keine intrinsische enzymatische Aktivität besitzen, leiten diese Tyrosinkinasen Signale von FAs an die zelluläre Maschinerie weiter, indem sie mehrere Integrin-assoziierte Proteine phosphorylieren. Somit fungieren sowohl FAK als auch Src als molekulare Schalter, die über FA-Komplexe eine Vielzahl von zellulären Reaktionen auslösen. Es gibt viele hervorragende Übersichtsarbeiten, die erörtern, wie Integrin-vermittelte Signale zelluläres Verhalten regulieren.

Abbildung 1

Integrin-vermittelte Zelladhäsion an die ECM. (a) Schwebende Zellen haften über Integrine an der Oberfläche der ECM. Einige der entstehenden Adhäsionskontakte wachsen und bilden reife fokale Adhäsionen (FAs). (b) Integrine funktionieren als Heterodimer, das aus α- und β-Ketten besteht. (c) Die zytoplasmatischen Teile der Integrine rekrutieren mehrere zelluläre Proteine und bilden vernetzte Plattformen, die sowohl das Aktinzytoskelett als auch die Signaltransduktion regulieren.

Der Prozess der Zelladhäsion an die ECM wurde untersucht, indem Zellen in Kultur auf ein ECM-beschichtetes Substrat gesät wurden. Diese Analysen trugen dazu bei, den Prozess der anfänglichen Anhaftung von Zellen an die ECM und die Bildung von Integrin-vermittelten Zelladhäsionsstrukturen zu klären. Allerdings müssen sich die Zellen während der Migration auch von der ECM lösen, und der Mechanismus und die Regulierung des Abbaus der Zelladhäsionsstrukturen sind weniger gut untersucht. Im Gegensatz zu den meisten Übersichtsartikeln, die sich mit der Zelladhäsion befassen, konzentrieren wir uns hier auf unser Verständnis des Umsatzes von FA-Komplexen während der Zellmigration.

2. Adhäsion von Zellen durch die Bildung von fokalen Adhäsionsstrukturen

Zellen haften über Integrine an der ECM und bilden FA-Komplexe, wie an anderer Stelle beschrieben. Zahlreiche Proteine sind an der Integrin-vermittelten Zelladhäsion beteiligt, und diese Proteine werden als Adhäsom bezeichnet. Unter den letzteren ist Talin ein wichtiger Regulator des ersten Schritts des FA-Aufbaus. Talin enthält zwei einzigartige Domänenstrukturen, die Kopf- und die Stabdomäne. Die Kopfdomäne vermittelt die Bindung an die CP der β-Untereinheit von Integrin, während die Stabdomäne mehrere Bindungsstellen für Adhäsom-Proteine enthält, darunter eine für die CP von β-Integrin, zwei Stellen für Aktin und mehrere Stellen für Vinculin. Darüber hinaus bildet Talin durch seine carboxyterminale Helix ein Dimer und dient somit als zentrale Plattform zur Erweiterung intrazellulärer struktureller Gerüste, die durch Protein-Protein-Interaktionen vermittelt werden. Die Bindung von Talin an Integrin stabilisiert die ligandeninduzierte Clusterbildung des letzteren in einem ersten Schritt der FA-Bildung, indem es die Vernetzung von Integrinen mit filamentösem Aktin (F-Aktin) und F-Aktin-bindenden Proteinen wie Vinculin und α-Aktinin vermittelt (Abbildung 3(a)). Diese anfängliche Struktur, die so genannte naszierende FA, ist unreif und oft kurzlebig. Einige der naszierenden FAs wachsen jedoch und bilden reife FAs, die eine aktinbasierte Spannung benötigen, die von der kleinen GTPase Rho und ihrem Effektor ROCK reguliert wird.

3. Regulierung der fokalen Adhäsionskomplexe während der Zellmigration

Die Stimulation der Bildung von FA-Komplexen verbessert die Adhäsion von Zellen an die ECM, wodurch Zellen mit einer Ausbreitungsmorphologie entstehen (Abbildung 2(i)). Im Gegensatz dazu verringert die Destabilisierung von FAs die Adhäsion an die ECM und führt zu kugelförmigen, nicht haftenden Zellen (Abbildung 2(ii)). Während der Zellmigration auf einem Substrat halten sich die FAs an der ECM fest, um die Kräfte zu erzeugen, die notwendig sind, um den Zellkörper vorwärts zu ziehen. Anschließend müssen sich die Zellen von der ECM lösen, um die Zellbewegung fortzusetzen. Die gerichtete Wanderung der Zelle erfordert also eine kontinuierliche, koordinierte Bildung und Umkehrung von FAs an der Vorderkante des Zellkörpers und die Loslösung dieser Bindung an der Rückseite (Abbildung 2(iii)). Die Clusterbildung von Integrinen ist der erste Schritt der Zelladhäsion und wird durch die Verknüpfung mit Aktinstressfasern in einem durch Rho/ROCK regulierten Prozess zur Bildung von FAs stabilisiert. Im Gegensatz dazu löst die Ausdehnung der Mikrotubuli auf die FAs deren Abbau aus und führt zu einer anschließenden Internalisierung der Integrine von der Zelloberfläche. Der Auf- und Abbau von FAs wird also durch unterschiedliche Mechanismen gesteuert. Obwohl der Verbleib der internalisierten Integrine noch nicht geklärt ist, wurde in mehreren Studien berichtet, dass internalisierte Integrine durch intrazellulären Vesikeltransport von der Rückseite zum vorderen Rand des Zellkörpers transportiert werden. Dieses Recycling von Integrinen könnte zur gerichteten Zellmigration beitragen.

Abbildung 2

Die Bildung und der Umsatz von FAs während der Zellmigration. Die Bildung und der Umsatz von FAs sind entscheidend für die Zelladhäsion an der ECM. Ein höheres Verhältnis von Bildung zu Umsatz führt zu einer stabilen Adhäsion (i). Andererseits führt ein höheres Verhältnis von Umsatz zu Bildung zu einer instabilen Adhäsion (ii). Während der Zellwanderung sind sowohl eine schnelle Bildung als auch ein schneller Umsatz von FAs am vorderen Rand der Zellwanderung erforderlich, während der Umsatz von FAs am hinteren Rand überwiegt (iii).

Abbildung 3

Bildung und Umsatz von FAs. (a) Der Prozess der Bildung von FAs. Die Anheftung von Zellen an die ECM führt zu einer Anhäufung von Integrinen an den Anheftungsstellen. Geclusterte Integrine rekrutieren zytoplasmatische Adaptorproteine wie Talin an den zytoplasmatischen Teil der Integrine. Aktin-bindende Proteine wie Vinculin und α-Actinin binden dann an Talin und verbinden die ECM-Struktur über Integrin mit dem Zytoskelett. (b) Der Prozess des FA-Umsatzes. FAK, das an Tyr397 phosphoryliert ist, spielt eine Rolle bei der Rekrutierung des Endozytoseregulators Dynamin in FAs durch Interaktion mit dem Adaptorprotein Grb2. Die Ausdehnung der MTs initiiert die Internalisierung der Integrine in einer Dynamin-abhängigen Weise. Während des Prozesses der Integrin-Endozytose wird eine rasche Dephosphorylierung von FAK an Tyr397 beobachtet.

4. Faktoren, die am Abbau von FAs beteiligt sind

Die molekularen Vorgänge, die zum Abbau von FAs führen, sind noch nicht gut verstanden, obwohl in letzter Zeit einige fragmentarische Erkenntnisse gewonnen wurden. Vor allem wurde festgestellt, dass Mikrotubuli (MTs) eine entscheidende Rolle beim Abbau von FAs spielen. MTs reichen bis zu den FAs und lösen den Abbauprozess aus. In der letzten Phase wird die Internalisierung von Integrinen durch Dynamin vermittelt, eine GTPase, die die Endozytose reguliert, und FAK ist an der Rekrutierung von Dynamin in FAs beteiligt (zusammengefasst in Abbildung 3(b)).

In den folgenden Abschnitten fassen wir die Proteine zusammen, die an der Demontage beteiligt sind, und verknüpfen ihre Beteiligung an diesem Prozess, um ein koordinierteres Modell der Demontage auf der Grundlage neuerer Erkenntnisse zu erstellen. Verschiedene Demontagefaktoren und ihre Domänenstrukturen sind in Abbildung 4 schematisch dargestellt.

Abbildung 4

Domänenstrukturen der FA-Demontagefaktoren. FAK: FERM (Protein 4.1, Ezrin-, Radixin- und Moesin-Homologie), PR (prolinreiches Motiv), FAT (focal adhesion targeting), pY (phosphoryliertes Tyrosin), Dynamin: PH (Pleckstrin-Homologie), GED (GTPase-Effektor-Domäne), PTP-PEST: PR (prolinreiches Motiv), SHP-2: SH2 (src homology 2 domain), PTP-1B: PR (prolinreiches Motiv), ERTD (endoplasmatische Retikulum-Ziel-Domäne), m-Calpain: I (mögliche autoinhibitorische Region), IIa und IIb (Proteasedomäne), III (mutmaßliche Phospholipid-Bindungsstellen) und IV (die Region mit 4 EF-Hand-Motiven), ZF21: FYVE (Fab1, YOTB, Vac1 und EEA1), PH-like (pleckstrin homology-like).

4.1. Mikrotubuli

Die Bedeutung der MTs für den Abbau von FA wurde mit Hilfe von Nocodazol nachgewiesen, das polymerisierte MTs in Zellen, die an der ECM haften, unterbricht. Wenn die Zellen Nocodazol ausgesetzt werden, stabilisiert es die FA-Strukturen, indem es ihren Abbau verhindert und dadurch die Adhäsion der Zellen an der ECM verbessert. Das Entfernen des Medikaments aus dem Kulturmedium löst den Abbau der FAs in synchroner Weise und die Wiederherstellung der MT-Strukturen aus. Die Verwendung dieses Medikaments ermöglicht es uns also, den FA-Abbauprozess unabhängig von der FA-Bildung zu analysieren. Die Tyrosinphosphorylierung von Proteinen innerhalb der FAs steigt nach der Exposition gegenüber Nocodazol an und nimmt nach dessen Entfernung rasch ab. Die Ausdehnung von MTs auf FAs wurde mit Hilfe von Live-Imaging-Mikroskopie beobachtet, und die Ausrichtung von MTs auf FAs scheint den FA-Abbau auszulösen. Da das MT-Motorprotein Kinesin-1 bei der Regulierung der MT-induzierten FA-Demontage eine Rolle spielt, könnten MTs auf eine Kinesin-1-abhängige Weise Demontagefaktoren an FAs liefern.

Da die Ausdehnung von MTs auf FAs die Freisetzung der Zelladhäsion auslöst und die Zellmigration fördert, ist es von Interesse, wie die Ausrichtung von MTs auf FAs während der Induktion der Zellmotilität reguliert wird. Tatsächlich regulieren GTPasen der Rho-Familie über ihre nachgeschalteten Effektoren das Einfangen und die Stabilisierung von verlängerten MTs an der Zellrinde, und es wurde gezeigt, dass MTs ihrerseits die Aktivität von Rho-GTPasen beeinflussen. Obwohl nicht genau klar ist, wie MTs FAs ansteuern, spielen Aktinfilamente vermutlich eine Rolle.

4.2. Kinesin-1

Kinesin-1 ist ein Mitglied der Kinesin-Superfamilie von Motorproteinen und wird auch als konventionelles Kinesin bezeichnet. Kinesin-1 spielt eine entscheidende Rolle beim Transport von Proteinen entlang der polymerisierten MTs in Richtung des Plus-Endes der MTs. Die Hemmung von Kinesin-1 in Xenopus-Fibroblasten, entweder durch einen spezifischen Antikörper oder durch forcierte Expression einer dominant-negativen Mutante, führt zu einer Stabilisierung von FAs, die mit einer Zunahme ihrer Größe und einer Verringerung ihrer Anzahl einhergeht, wie dies auch in Zellen beobachtet wurde, die Nocodazol ausgesetzt waren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aktivität von Kinesin-1 für den Umsatz von FAs notwendig ist. Obwohl Nocodazol die Polymerisation von MTs hemmt, wirkt sich die Hemmung der Kinesin-1-Aktivität weder auf die Ausrichtung von MTs auf FAs noch auf die Polymerisationsdynamik von MTs aus. Dies deutet darauf hin, dass FA-Abbaufaktoren entlang der MTs in einer von Kinesin-1 abhängigen Weise transportiert werden.

4.3. Fokale Adhäsionskinase

FAK ist sowohl an der Reifung als auch am Umsatz von FAs beteiligt. Ein Mangel an FAK wirkt sich jedoch stärker auf den Abbau als auf die Bildung von FAs aus, was zu einer verringerten FA-Umsatzrate und damit zu einem Anstieg der FAs im Steady-State führt. FAK enthält eine N-terminale FERM-Domäne (Protein 4.1, Ezrin-, Radixin- und Moesin-Homologie), eine zentrale Kinasedomäne und eine COOH-terminale Focal-Adhesion-Targeting-Domäne (FAT), wie in Abbildung 4 dargestellt. Die FERM-Domäne ist in vielen Proteinen zu finden und vermittelt Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die FERM-Domäne von FAK bindet nachweislich an die CP von Integrin β1 und Wachstumsfaktorrezeptoren. Jüngste Strukturanalysen der FERM-Domäne haben gezeigt, dass sie an den katalytischen Spalt der Kinasedomäne bindet. Diese intramolekulare Interaktion verhindert die Autophosphorylierung von Tyr397, die eine Voraussetzung für die anschließende Phosphorylierung von FAK durch Src ist. Die Autophosphorylierung von FAK an Tyr397 ist in hochbeweglichen und invasiven Krebszellen erhöht. Src bindet an das phosphorylierte Tyr397 und phosphoryliert anschließend mehrere Tyrosinreste innerhalb von FAK, darunter Tyr576 und Tyr577 innerhalb der Kinasedomäne, Tyr861 zwischen der Kinase- und der FAT-Domäne und Tyr925 innerhalb der FAT-Domäne. Die Phosphorylierung innerhalb der Kinasedomäne ist entscheidend für die volle Kinaseaktivität. Das phosphorylierte Tyr861 vermittelt die Interaktion von FAK mit Talin und Paxillin. Die Phosphorylierung an Tyr925 ist für die Interaktion von FAK mit Grb2 erforderlich. Die Bindung von Grb2 an FAK trägt zur Rekrutierung von Dynamin an FAs bei. Dieser ternäre Komplex ist für die Internalisierung von Integrinen verantwortlich und leitet dadurch den Umsatz von FAs ein. Die Rolle von FAK während des Abbaus von FA ist jedoch nicht so einfach. Während pTyr397 FAK für die Rekrutierung von Dynamin erforderlich ist, wird seine Dephosphorylierung nach der Ausdehnung von MTs zu FAs induziert, und dies ist ein notwendiger Schritt für den anschließenden Abbau von FAs. FAK ist also ein zentraler Regulator für die Bildung und den Abbau von FAs und für die Übertragung von Integrin-vermittelten Signalen. Ein Mangel an FAK hat jedoch kaum Auswirkungen auf die FA-Bildung, stabilisiert aber nachweislich FAs. Die Rolle von FAK bei der FA-Bildung könnte von anderen redundanten Kinasen oder Faktoren übernommen werden, die zu FAs rekrutiert werden.

4.4. Dynamin

Dynamin ist eine GTPase, die als ein MT-bindendes Protein identifiziert wurde. Es wurden drei unabhängige Dynamin-Gene identifiziert. Dynamin I wird spezifisch in Neuronen exprimiert, während Dynamin III ausschließlich in Hoden, Lunge und Gehirn vorkommt, während Dynamin II ubiquitär exprimiert wird. Die gemeinsame Domänenstruktur der Dynamine ist in Abbildung 4 dargestellt. Dynamin ist für die Internalisierung von Integrinen während des MT-abhängigen FA-Umsatzes erforderlich. Der Carboxylterminus von Dynamin enthält ein prolinreiches (PR) Motiv, das für den Aufbau eines ternären Komplexes mit FAK und Grb2 unerlässlich ist. Das PR-Motiv von Dynamin interagiert auch mit MTs. Dynamine, die an der inneren Oberfläche der Zellmembran rekrutiert werden, sammeln sich in einem Ring um FAK und leiten die Internalisierung von Integrinen ein, wenn die FAK ausreichend abgebaut sind. Bei FAK-Mangel ist die Anhäufung von Dynamin um FAs deutlich reduziert. Die Interaktion des Tubulin-Polymers mit Dynamin erhöht die GTPase-Aktivität des letzteren deutlich, obwohl die physiologische Bedeutung dessen unklar ist.

4.5. Phosphatasen

Eine spezifische Gruppe von Protein-Tyrosin-Phosphatasen vermittelt die Dephosphorylierung von FAK an Tyr397 nach der Verlängerung von MTs zu FAs . Dazu gehören PTP-PEST, SHP-2 und PTP-1B. Es ist jedoch nicht klar, ob der Abbau von FA eine konzertierte Aktion aller drei Phosphatasen erfordert oder ob die Aktion einer einzelnen Phosphatase ausreicht, je nach zellulärem Kontext.

PTP-PEST ist dafür bekannt, dass es die Zelladhäsion und -migration reguliert (Abbildung 4) . Wie Zheng et al. berichteten, dephosphoryliert PTP-PEST FAK an Tyr397 bei Aktivierung durch ein onkogenes Ras-induziertes Signal. Ras löst die Aktivierung von ERK über die Fgd1-Cdc42-PAK1-MEK1-Kaskade aus, was letztlich zu einer Interaktion zwischen FAK und PTP-PEST führt. Die aktivierte ERK phosphoryliert FAK an Ser910, und das phosphorylierte Ser910 und der angrenzende Pro911-Rest dienen als Bindungsstelle für Peptidyl-Prolyl-Cis/Trans-Isomerase (PIN1). PIN1 stimuliert die Bindung von FAK an PTP-PEST in einer Weise, die von der Isomeraseaktivität von PIN1 abhängt, wobei die genaue Rolle der Isomeraseaktivität nicht klar ist. PTP-PEST dephosphoryliert dann pTyr397 . Interessanterweise fördert die Substitution von FAK-Tyr397 durch Phe die Metastasierung von v-H-Ras-transformierten Rattenfibroblasten.

SHP-2 kann FAK ebenfalls an Tyr397 dephosphorylieren. SHP-2 enthält zwei SH2-Domänen an seinem N-Terminus (Abbildung 4), und die N-terminale der beiden Domänen wirkt als intramolekularer Inhibitor der Phosphataseaktivität. Diese Hemmung kann durch Gab2, ein Pleckstrin-Homologie (PH)-Domäne enthaltendes Andockprotein, aufgehoben werden. Gab2 bindet an die N-terminale SH2-Domäne und legt die Phosphatasedomäne von SHP-2 frei, indem es die intramolekulare Hemmung aufhebt. Ein Mangel an SHP-2 in kultivierten Zellen erhöht die Anzahl der FAs und beeinträchtigt die Zellmigration. Diese Befunde erinnern an den Phänotyp von Zellen mit FAK-Mangel. Es gibt jedoch keine eindeutigen Beweise dafür, dass sich SHP-2 während des Umsatzes von FAs an diese anlagert. SHP-2 könnte an FAs rekrutiert werden, indem es über seine beiden SH2-Domänen mit den phosphorylierten Tyrosinen von Gab2 interagiert.

Es gibt mehrere Substrate für PTP-1B in FAs, darunter FAK, Src und α-Actinin. PTP-1B ist ein komplizierter Regulator von FAK. Es vermittelt direkt die Dephosphorylierung von pTyr397, kann aber auch die Phosphorylierung desselben Tyrosinrests durch Src fördern. Wie Zhang berichtete, spielt α-Actinin eine Schlüsselrolle bei den Doppelfunktionen von PTP-1B. α-Actinin, das an Tyr12 phosphoryliert ist, fördert die Dissoziation von Src, das an pTyr397 an FAK gebunden ist. Dies ermöglicht es PTP-1B, das exponierte pTyr397 zu dephosphorylieren. Andererseits kann PTP-1B das α-Actinin pTyr12 dephosphorylieren, um den α-Actinin-freien Src-Pool zu vergrößern, der dann für die Phosphorylierung von FAK zur Verfügung steht. Gleichzeitig kann PTP-1B Src aktivieren, indem es Src pTyr527 dephosphoryliert, was eine intramolekulare Hemmung der Src-Aktivität bewirkt. Insgesamt verstärkt die Dephosphorylierung von FAK durch PTP-1B die anschließende Phosphorylierung von FAK durch Src. Diese Funktionen von PTP-1B spielen möglicherweise eine Rolle beim dynamischen Umsatz von FAK während der dynamischen Zellanhaftung und nicht nur bei der Förderung der Ablösung.

4.6. m-Calpain

m-Calpain, auch bekannt als Calpain-2, ist ein Mitglied der Calpain-Familie der intrazellulären kalziumabhängigen Proteasen. Es besteht aus fünf funktionell und strukturell unterschiedlichen Domänen. Domäne I ist eine mögliche autoinhibitorische Region, die durch Autolyse abgespalten wird. Domäne II ist eine katalytische Domäne, die aus zwei geteilten Subdomänen (IIa und IIb) besteht, die durch eine Schleife, den so genannten katalytischen Spalt, verbunden sind. Domäne III ist eine mutmaßliche regulatorische Region der Proteaseaktivität und enthält Phospholipid-Bindungsstellen. Domäne IV enthält vier EF-Hand-Motive, die für die Bindung von Kalzium erforderlich sind.

m-Calpain reguliert nachweislich den Umsatz von FAs, indem es mehrere mit FAs verbundene Proteine wie Talin, FAK und Paxillin spaltet. Talin ist ein bekanntes Substrat von m-Calpain während des Umsatzes von FAs. m-Calpain spaltet eine Stelle zwischen der Kopf- und der Stabdomäne und löst dadurch den strukturellen Abbau des FA-Gerüsts aus. FAK wird ebenfalls von m-Calpain zwischen den beiden C-terminalen PR-Domänen gespalten. Für die Spaltung von FAs durch m-Calpain sind auch MTs erforderlich. Auch wenn die genaue Rolle von MTs beim Abbau von FAs durch m-Calpain unklar ist, spielt ZF21 vermutlich eine Rolle, wie im nächsten Abschnitt erläutert wird. FAK kann sowohl ERK/MAPK als auch m-Calpain binden und könnte eine Plattform sein, auf der m-Calpain durch ERK/MAPK aktiviert werden kann. Die Spaltung von Komponenten von FAs durch m-Calpain erleichtert vermutlich die Internalisierung von Integrinen, indem sie die große zusammenhängende Struktur von FAs unterbricht.

4.7. ZF21

ZF21 enthält eine FYVE-Domäne, die an Phosphatidylinositol-3-phosphat bindet, das in den Lipidschichten der Plasmamembranen angereichert ist. Obwohl es bei Säugetieren 38 FYVE-Domänen-haltige Proteine gibt, haben sie nicht unbedingt gemeinsame Domänenstrukturen oder Funktionen. ZF21 erregte zunächst unsere Aufmerksamkeit als möglicher Interaktionspartner des zytoplasmatischen Schwanzes der membranständigen Metalloproteinase MT1-MMP, wurde aber später als Regulator des FA-Umsatzes identifiziert. ZF21 wird fast ubiquitär in verschiedenen Arten von adhäsiven Zellen exprimiert. Die FYVE-Domäne von ZF21 befindet sich in der Mitte des Proteins, und der C-terminale Bereich des Proteins enthält eine neuartige Proteinfaltung, die der PH-Domäne ähnelt, der aber die positiv geladenen Aminosäuren fehlen, die zur Bindung von Phospholipid erforderlich sind. Interessanterweise bindet ZF21 mehrere FA-Abbauproteine, darunter FAK, β-Tubulin, m-Calpain und SHP-2. Die FYVE-Domäne von ZF21 bindet FAK, und die PH-ähnliche Domäne bindet β-Tubulin. Fast die gesamte Polypeptidkette von ZF21 ist für die Bindung von m-Calpain und SHP-2 erforderlich. Die Substitution der FYVE-Domäne von ZF21 durch eine entsprechende Domäne, die von EEA1, einem anderen Mitglied der FYVE-Domäne-enthaltenden Proteine, abgeleitet ist, hebt seine Fähigkeit auf, FAK zu binden, und hebt seine Fähigkeit auf, den MT-induzierten FA-Abbau zu vermitteln.

Die Unterdrückung der ZF21-Expression in Zellen verhindert den MT-induzierten FA-Abbau sowie mit dem Abbau zusammenhängende Ereignisse, wie die Dephosphorylierung von FAK an pTyr397 und die Internalisierung von Integrinen. Die Bindung von ZF21 an FAK ist wichtig für die Regulierung des FA-Abbaus, da der Ersatz der FYVE-Domäne durch die von EEA1 sowohl die FAK-Bindung als auch den FA-Abbau aufhebt. Auch die PH-ähnliche Domäne ist für die Aktivität von ZF21 unerlässlich. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ZF21 mit endosomalen Vesikeln, die sich auf MTs bewegen, über eine Interaktion zwischen der FYVE-Domäne und Phosphatidylinositol-3-phosphat innerhalb der Vesikelmembran assoziiert. Die PH-ähnliche Domäne, die eine Interaktion mit β-Tubulin vermittelt, kann dazu beitragen, die Interaktion von ZF21 mit MTs zu stabilisieren und dann auf Vesikeln zu reiten. Die Fähigkeit von ZF21, SHP-2 und m-Calpain zu binden, könnte den Transport der letzteren zu FAs über Vesikel, die auf MTs geladen sind, erleichtern (Abbildung 5). Nach der Ausrichtung von MTs auf FAs kann ZF21 auf FAs übertragen werden, da es FAK binden kann, und das auf die FAs übertragene ZF21 kann anschließend die MTs an den FAs verankern. Gab2 in den FAs kann die Dephosphorylierung von FAK durch SHP-2 auf den MTs erleichtern. Auf diese Ereignisse folgt vermutlich der Abbau der FA-Komponenten durch die proteolytische Aktivität von m-Calpain.

Abbildung 5

Ein Modell für die Rekrutierung von Abbaufaktoren an FAs. In diesem Modell transportiert ZF21 die FA-Demontagefaktoren über intrazellulären Vesikeltransport auf MTs. ZF21 assoziiert mit endosomalen Vesikeln, indem es über seine FYVE-Domäne an Phosphatidylinositol-(3)-phosphat bindet. m-Calpain und SHP-2 können auf ZF21 geladen werden, das von den Vesikeln getragen wird. ZF21 kann auch in FAs gefunden werden, indem es mit FAK interagiert, und die Fähigkeit von ZF21, β-Tubulin zu binden, kann als Andockfunktion für die verlängerten MTs in FAs fungieren, um die transportierten Faktoren am Zielort zu entladen.

Die Bedeutung von ZF21 für die Zellmigration gab uns einen Hinweis darauf, seine Rolle beim FA-Umsatz zu verstehen. Die Unterdrückung der ZF21-Expression durch shRNA in Krebszellen induzierte die Zellausbreitung auf der ECM und unterdrückte die Zellmigration. Integrin-vermittelte Zelladhäsion und -migration sind während der Invasion und Metastasierung von Krebszellen wichtig, obwohl FA-ähnliche Strukturen in den meisten Zellen, die von ECM umgeben sind, nicht offensichtlich erkennbar sind. In der Tat unterdrückt die Unterdrückung der ZF21-Expression in menschlichen Mammakarzinomzellen MDA-MB231 die Bildung von Metastasen in der Lunge nach Injektion der Zellen in die Schwanzvene von Mäusen. Es ist jedoch möglich, dass ZF21 die Metastasierung von Krebszellen durch andere Mechanismen als die Regulierung des Umsatzes von FAs reguliert.

5. Schlussfolgerung

Unser Verständnis des Mechanismus des FA-Umsatzes ist noch lückenhaft. Die Mechanismen, die die Migration von Zellen durch regulierte Adhäsion steuern, sind jedoch entscheidend für das Verständnis der Invasion und Metastasierung von Krebszellen. Der Turnover von FAs wird durch die Ausdehnung von MTs zu FAs eingeleitet und durch die Internalisierung von Integrinen von der Zelloberfläche abgeschlossen. Mehrere Faktoren wurden in den Prozess der FA-Demontage einbezogen. Insbesondere das kürzlich entdeckte ZF21 hat diesen Prozess beleuchtet, da es in der Lage ist, mehrere am FA-Abbau beteiligte Proteine zu binden. Es ist bemerkenswert, dass FAs in Zellen, die in einem Kollagengitter kultiviert werden, nicht beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Integrin-basierten Zelladhäsionsstrukturen davon abhängt, ob die Zellen an einer starren Oberfläche (2D) haften oder in eine dreidimensionale ECM (3D) eingebettet sind. Moderne Bildgebungstechnologien sind leistungsstarke Werkzeuge, um die dynamische Rolle von FA-Abbaufaktoren während der Zellmigration und -invasion aufzuklären.

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