February 15, 2010 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Einfache Schritte für ein erfolgreiches Biolumineszenz-Tier-Imaging

Luciferin ist das Basissubstrat von Biolumineszenz-Tests. Die Biolumineszenz basiert auf einer einfachen Reaktion, bei der ATP die Katalyse der Luciferase des Glühwürmchens (Käfer) Luciferin antreibt, um Licht zu erzeugen, und findet breite Anwendung. Ihr Einsatz als Biomasse-Indikator ermöglicht den Nachweis von Mikroorganismen in Konsumgütern, auf der Oberfläche von Produktionsanlagen und wurde sogar zur Feststellung der Existenz von Leben auf dem Mond und dem Mars verwendet.

Biolumineszenz wird bei der In-vitro- und In-vivo-Überwachung biologischer Prozesse einschließlich der Genexpression und der Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Luciferin wird beispielsweise in Reportergen-Assays verwendet, um die Genregulation und -funktion zu untersuchen, wobei die Expression des mit Luciferin markierten Reporters ein Marker für die erfolgreiche Aufnahme des interessierenden Gens bei rekombinanten DNA-Techniken ist. Als Nachweisreagenz wird die Luciferin-Luciferase-Reaktion bei der Pyrosequenzierung eingesetzt, um eine schnelle Detektion von Basen in den heutigen Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungssystemen zu erreichen.

In jüngerer Zeit hat sich die Biolumineszenz-Bildgebung als leistungsfähige Technik für die direkte Untersuchung verschiedener Zellpopulationen in lebenden Kleintieren wie Mäusen erwiesen. Bei dieser Technik werden Zellen (z. B. Krebszellen, Stammzellen, T-Zellen) so konzipiert, dass sie Luziferase exprimieren und leuchten. Die nichtinvasive Visualisierung in lebenden Tieren mit einer empfindlichen Kamera mit Ladungskopplungselementen ermöglicht die Echtzeitbeobachtung des Fortschreitens und der Rückbildung der Krankheit zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der therapeutischen Behandlung. Diese Technik wird eingesetzt, um die molekularen Grundlagen von Krankheiten wie neurodegenerativen Störungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fettleibigkeit und Krebs zu verstehen, und ist von großem Wert für die klinische und diagnostische Forschung sowie die Entwicklung von Arzneimitteln.

Wissenschaftler von Regis Technologies haben häufige Schwachstellen bei Luciferase-Assays festgestellt. Probleme treten oft auf, bevor der Assay beginnt. Glühwürmchen-Luciferin ist ein empfindliches Molekül, und selbst gut geplante Experimente können fehlerhafte Ergebnisse liefern, wenn das Luciferin vor der Verwendung falsch gehandhabt und beschädigt wird. In diesem Artikel beschreiben wir das optimale Salz, die Reinheit, die Handhabung und die Lagerung von Luciferin, um erfolgreiche und konsistente Ergebnisse bei der Bildgebung von Tieren und anderen Versuchen zu gewährleisten.

Überlegungen zum Kauf

Forscher fragen sich oft, welche Form von Luciferin sie verwenden sollen. Die Kalium- und Natriumsalze von Luciferin werden gewöhnlich austauschbar verwendet. Die Auflösung des Moleküls ist jedoch ein wichtiger Faktor, der bei einigen Assays zu berücksichtigen ist. Das Natriumsalz ist besser in Wasser löslich (>100 mg/ml) als das Kaliumsalz (55 mg/ml). Die Form mit freier Säure ist zwar noch erhältlich, wird aber wegen ihrer schwierigen Löslichkeit nicht häufig verwendet.

Da einige Verunreinigungen die Experimente auf unterschiedliche Weise beeinflussen können, kann die anfängliche Reinheit des Reagens ein wichtiger Faktor sein.

L-Luciferin, ein Enantiomer von D-Luciferin (Abbildung 1), ist eine bekannte Verunreinigung in synthetischem Luciferin. Es funktioniert zwar nachweislich in Luciferase-Reaktionen, aber je nach den verwendeten Parametern für die Datenerfassung kann es zu einer erheblichen Verschiebung der Spitzenlichtemission kommen. L-Luciferin lässt sich mit chiraler HPLC leicht nachweisen und quantifizieren und sollte auf dem Analysenzertifikat des Herstellers angegeben werden. Das meiste Luciferin sollte weniger als 0,5 % L-Luciferin enthalten, obwohl höhere Grenzwerte wahrscheinlich toleriert werden können, solange der L-Luciferin-Gehalt während des gesamten Experiments konstant bleibt.

Dehydroluciferin (Abbildung 1) ist eine Verunreinigung, die als Inhibitor der Luciferase wirkt und die Blitzhöhe und Gesamtintegration unterdrückt. Eine mit 1 % Dehydroluciferin dotierte Probe zeigt weniger als die Hälfte der Blitzhöhe und weniger als 25 % der Gesamtintegration über 15 Minuten. Dehydroluciferin kann sich bei der Synthese oder Lagerung von Luciferin bilden. Die Auswahl eines Herstellers, der niedrige Dehydroluciferinwerte liefert, trägt dazu bei, zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse zu gewährleisten.

Viele übliche Spurenverunreinigungen aus der Synthese von Luciferin können andere Enzyme in komplexen Systemen hemmen und können aufgrund von Unterschieden von Charge zu Charge oder von Hersteller zu Hersteller experimentelle Schwankungen verursachen.

Abbildung 1. Struktureller Vergleich von D-Luciferin und Verunreinigungen

Lagerung

Firefly-Luciferin ist empfindlich gegenüber Licht, Sauerstoff und Feuchtigkeit und muss geschützt werden. Licht und Sauerstoff können die Oxidation von Luciferin zu Dehydroluciferin katalysieren. In einer bernsteinfarbenen Flasche unter Stickstoff bei Raumtemperatur beginnt sich Luciferin nach einem Monat zu Dehydroluciferin zu zersetzen (Abbildung 2), ist aber in einer ungeöffneten Flasche im Gefrierschrank mindestens zwei Jahre lang stabil. Gelöst in Wasser mit ausreichend Sauerstoff wird Luciferin in nur wenigen Tagen zu Dehydroluciferin umgewandelt.

Luciferin sollte in der kleinstmöglichen Menge gekauft und gelagert werden, um zu verhindern, dass es durch mehrfaches Einfrieren, Auftauen und Öffnen zu Dehydroluciferin zerfällt. Wenn das Luciferin-Reagenz als Bulkware gekauft wird, hilft es, die Stabilität zu gewährleisten, indem man es auf Einweg-Bernsteinfläschchen aufteilt. Eine langfristige Lagerung als gefrorene Lösung wird für empfindliche Anwendungen wie Studien an ganzen Tieren nicht empfohlen. Um die Zersetzung in gefrorenen Lösungen zu verlangsamen, sollte die Lösung vor dem Einfrieren mit Stickstoff oder Argon gespült werden.

Abbildung 2. Luciferin-Zersetzung zu Dehydroluciferin in Abhängigkeit von der Zeit bei 25 ºC und -20 ºC

Handhabung

Nach dem Öffnen muss die Luciferin-Flasche vollständig auf Raumtemperatur kommen und dann mit Stickstoff oder Argon gespült werden, bevor sie wieder verschlossen wird. Wenn die Luciferinlösungen innerhalb weniger Stunden verwendet werden sollen, sind nur wenige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Lösungen, die über einen Tag verwendet werden, sollten mit Stickstoff oder Argon gespült werden. Lösungen sollten nicht über mehrere Tage verwendet werden, da es zur Bildung von Dehydroluciferin kommt.

Scott B. Mohler ([email protected]) ist Produktmanager bei Regis Technologies. Website: www.registech.com.