Fallbericht

Ein 5-jähriger Junge wurde im Dezember 1994 mit akuter lymphatischer Leukämie diagnostiziert und in das Fralle 93-Protokoll aufgenommen. Das Kind erreichte 6 Wochen nach Beginn der Induktionschemotherapie eine hämatologische Remission. Er wurde ambulant behandelt und sprach in den folgenden Jahren gut auf die Behandlung an. Bei einer Konsultation im März 1997 erlitt der Patient jedoch einen Fieberanfall, als er mit dem Port-a-cath-System perfundiert wurde. Die klinische Untersuchung ergab keine septische Lokalisation. Die Leukozytenzahl betrug 10.860/ml, die absolute Neutrophilenzahl lag bei 8.850/ml. Ein Satz Blutkulturen wurde aus dem Port-a-cath-System entnommen, und die aerobe Flaschenkultur ergab gelb-pigmentierte Kolonien von gram-positiven coryneformen Stäbchen. Der Junge erhielt einmalig Ceftriaxon (1 g) intravenös, gefolgt von Cefadroxil 500 mg zweimal täglich für 7 Tage. Wegen des anhaltenden Fiebers wurde Cefadroxil eine weitere Woche lang verabreicht, und die immunsuppressiven Medikamente wurden im gleichen Zeitraum abgesetzt. Die Anamnese des Patienten war in den nächsten 2 Monaten unauffällig, und bei den monatlichen Visiten wurde keine Blutkultur angelegt. Im Juni 1997 wurde das Kind mit subfebrilem Fieber und Müdigkeit zur Untersuchung vorgestellt. Bei der körperlichen Untersuchung wurde kein Infektionsherd festgestellt, und die Leukozytenzahl war nicht erhöht. Ein Satz Blutkulturen wurde aus dem Port-a-cath entnommen, und die aerobe Ampulle zeigte dieselben gram-positiven coryneformen Stäbchen, die später als Microbacterium sp. identifiziert wurden. Ampicillin (100 mg/kg/Tag) wurde perioperativ intravenös verabreicht, wobei die erste Dosis 24 Stunden vor der Operation gegeben wurde. Der klinische Zustand des Patienten verbesserte sich danach rasch. Der Port-a-cath wurde auf Columbia-Blutagar kultiviert. Innerhalb von 24 Stunden bei 37 °C wuchs eine Reinkultur mit gelb pigmentierten Kolonien eines nicht fermentativen, grampositiven, etwas verfärbten Stäbchens. Leider gingen die Subkulturen verloren, so dass keine weiteren Untersuchungen durchgeführt werden konnten.

Der aus den Blutkulturen des Patienten isolierte Stamm mit der Bezeichnung CF36 war eine gelbpigmentierte, bewegliche Coryneform mit einem oxidativen Stoffwechsel, proteolytischer Aktivität und zellulären Fettsäuren vom verzweigten Typ. Diese allgemeinen Merkmale deuten auf die Gattung Microbacterium hin, die sowohl fermentative als auch oxidative Arten umfasst, wobei letztere früher als Aureobacterium bezeichnet wurden (13).

Die Sequenz des 16S rRNA-Gens (rDNA) wurde unter Verwendung eines Satzes von Primern zur Amplifikation untersucht. Die PCR-Produkte wurden mit einem QIAquick-Gelextraktionskit (Qiagen, Westburg, Niederlande) von einem Agarosegel gereinigt. Die Sequenzanalyse wurde mit einem automatischen DNA-Sequenzer 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien) unter Verwendung des ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit durchgeführt. Jede Sequenz wurde mit Hilfe von BLAST (10) mit den in Datenbanken verfügbaren Sequenzdaten verglichen. Ein phylogenetischer Baum wurde mit der Methode der Nachbarschaftsverbindung (8, 11) erstellt.

Die 16S rDNA-Sequenzierung auf der Grundlage von 1.490 Nukleotiden des Stammes CF36 ergab den höchsten Ähnlichkeitsgrad von 99,5 % mit der Sequenz von M. luteolum DSM 20143T und 99,3 % mit der Sequenz von M. oxydans DSM 20578T. Er war auch eng mit den Sequenzen von M. saperdae (99,2 %) und M. liquefaciens (99,1 %) verwandt (Tabelle (Tab.1).1). Vier weitere ähnliche Stämme wurden aus verschiedenen Proben von anderen Patienten gewonnen, die mit CF7 aus einer Blutkultur, CF34 aus einem Bronchialaspirat, CF130 aus einer Blutkultur und CF40 aus einer unbekannten menschlichen Quelle bezeichnet wurden. Ein weiterer Stamm, CF128, wurde aus einer Gemüseprobe gewonnen. Die fünf Stämme wiesen 16S rDNA-Sequenzen auf, die denen des Typstamms von M. oxydans ähnlich waren, wobei die Ähnlichkeit zwischen 99,3 und 99,4 % lag, während die Ähnlichkeitsraten mit CF36 99,9 bis 100 % betrugen. Neun weitere klinische Isolate wiesen eine Ähnlichkeit von 99,9 bis 100 % mit dem Typstamm von M. oxydans auf.

Diese Ergebnisse haben uns dazu veranlasst, eine umfassende Studie der folgenden sechs Stämme durchzuführen: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 und CF130.

Die zellulären Fettsäuren, die wie zuvor beschrieben (14) bestimmt wurden, zeigten bei allen Stämmen das gleiche Profil. Die durchschnittlichen Prozentsätze der wichtigsten zellulären Fettsäuren waren wie folgt: 40,3 % anteiso-C15:0 (Bereich, 37,1 bis 46,0 %), 27 % anteiso-C17:0 (Bereich, 22,9 bis 31,3 %), 15,7 % iso-C16:0 (Bereich, 13,8 bis 19,3 %), 9,3 % iso-C15:0 (Bereich, 4,6 bis 13,9 %), und 4,2 % iso-C17:0 (Bereich, 3,0 bis 7,2 %).

Die Analyse des CF36- und CF7-Zellwandpeptidoglycans wurde an der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Deutschland) von N. Weiss mit einem Dünnschichtchromatographieverfahren nach Schleifer und Kandler (12) durchgeführt. Das Peptidoglykan war vom B2β-Typ mit d-Ornithin als Diamino-Säure.

DNA-DNA-Hybridisierung wurde von P. Schumann an der DSMZ durchgeführt, wie von De Ley et al. (3) mit den Modifikationen von Escara und Hutton (4) und Huss et al. (7) beschrieben. Die DNA-Homologierate von CF36 mit M. luteolum LMG 16207T betrug nur 33,7 % und die mit M. oxydans DSM 20578T 46,6 %, aber hohe DNA-Verwandtschaftsgrade von 78,1, 81,8 bzw. 78,2 % wurden mit den Stämmen CF7, CF34 und CF40 erzielt. Dies steht im Einklang mit ihrer Zuordnung zu einer einzigen Art. Der G+C-Gehalt der DNA von Stamm CF36 betrug 69,9 mol%, wie am DSMZ bestimmt.

Die sechs Stämme waren gram-positive, bewegliche, coryneforme Stäbchen. Sie wuchsen gut auf Columbia-Blutagar bei 37°C, und die Farbe der Kolonien war gelb. Die Stämme waren streng aerob, Katalase-positiv und Oxidase-negativ. Sie waren in der Lage, Esculin und Gelatine zu hydrolysieren. Obwohl die 16S rDNA-Sequenzierung eine enge Verwandtschaft mit M. luteolum, M. saperdae und M. liquefaciens ergab, waren diese Arten phänotypisch recht unterschiedlich. Keine von ihnen wuchs bei 37 °C, M. luteolum und M. liquefaciens waren unbeweglich, und M. luteolum und M. saperdae waren nicht proteolytisch. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Angaben in der Literatur (2). Die phänotypischen Eigenschaften der Stämme waren denen von M. oxydans am ähnlichsten. Glucose wurde oxidativ auf Phenolrot-Agar mit niedrigem Peptongehalt angesäuert (15). Alle Stämme wuchsen bei 40 °C, während keines der M. oxydans-Isolate in der Lage war, bei dieser Temperatur zu wachsen. Außerdem wurde Salicin im Gegensatz zu M. oxydans nicht angesäuert. Die neuen Stämme konnten auch durch API 50CH Assimilationsstreifen (bioMérieux) von M. oxydans unterschieden werden. Laktose wurde verwertet, 2-Ketogluconat dagegen nicht, während M. oxydans die gegenteiligen Reaktionen zeigte. Bei der Verwendung von API ZYM-Streifen (bioMérieux) wurden die sechs Stämme durch negative Reaktionen auf Esterase-Lipase (C8), α-Chymotrypsin und β-Glucosidase von M. oxydans getrennt. Phänotypische Merkmale, die die neuen Stämme von verwandten oxidativen, beweglichen, proteolytischen Microbacterium-Spezies unterscheiden, die bei 37°C wachsen, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die Antibiotika-Empfindlichkeit wurde auf Mueller-Hinton-Agar mit E-Teststreifen (PDM, Solna, Schweden) getestet. Die MHK-Bereiche (Mikrogramm pro Milliliter) waren wie folgt: Penicillin, 1,5 bis 2; Ampicillin, 1 bis 1,5; Cefotaxim, 3 bis 6; Cephalothin, 16 bis 24; Ciprofloxacin, 1 bis 1,5; Gentamicin, 2 bis 3; Vancomycin, 3 bis 4; Clarithromycin, <0,016.

Phänotypische, chemotaxonomische und genetische Untersuchungen deuten darauf hin, dass die sechs untersuchten Stämme zur Gattung Microbacterium gehören, aber eine neue Art bilden, für die der Name Microbacterium paraoxydans vorgeschlagen wird und die eng mit M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum und M. liquefaciens verwandt ist (Abb. (Abb.11).

Nur wenige Berichte befassen sich mit der Isolierung von Microbacterium-Arten aus klinischem Material. Die meisten wurden zunächst der CDC-Gruppe A-4 oder A-5 zugeordnet, und selbst neuere Isolate wurden nur selten auf Artniveau identifiziert (1, 5, 6, 9). Nur in wenigen Fällen erwies sich das Isolat als der Erreger der Infektion. Funke et al. berichteten über einen Fall von Endophthalmitis, der durch ein Microbacterium verursacht wurde, und auf der Grundlage der 16S rDNA-Sequenzierung wurde angenommen, dass der Stamm zu einer unbeschriebenen Art gehört (6). In einer Studie über Microbacterium spp. in klinischen Proben wurden mehrere Stämme als M. arborescens und M. imperiale identifiziert, aber es wurde keine genetische Bestätigung vorgenommen (5). Bei Krebspatienten wurde ein nosokomialer Ausbruch von Bakteriämie im Zusammenhang mit Microbacterium gemeldet, aber der verursachende Organismus wurde nicht bis auf Artniveau identifiziert. Ein zentraler Venenkatheter war in dieser Studie der Hauptrisikofaktor (1). In jüngerer Zeit wurden zwei Fälle von katheterbedingter Microbacterium-Bakteriämie gemeldet, die durch 16S rDNA-Sequenzierung identifiziert wurden. Ein Isolat war zu 99,4 % mit M. oxydans und das andere zu 98,7 % mit M. trichothecenolyticum verwandt, aber eine formale Identifizierung auf Speziesebene wurde nicht erreicht (9).

Stamm CF36 wurde aus Blutkulturen des Patienten im Abstand von mehreren Wochen isoliert, und obwohl der aus dem entfernten Katheter isolierte Organismus nur teilweise identifiziert werden konnte, ist es wahrscheinlich, dass die wiederholte Bakteriämie mit dem Katheter zusammenhing, was bestätigt, dass intravaskuläre Katheter einen Risikofaktor für die Infektion mit diesen Organismen darstellen. Ihr Ursprung könnte die Haut des Patienten sein, aber da der natürliche Lebensraum von Mikrobakterien die unbelebte Umwelt ist, kann die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, dass kontaminierte Perfusionsflüssigkeit den Katheter des Patienten besiedelt hat.

In den letzten Jahrzehnten haben wir in unserem Labor 30 Mikrobakterienisolate menschlichen Ursprungs gesammelt. Alle diese Stämme wurden anhand einer Reihe von phänotypischen und chemotaxonomischen Merkmalen und durch 16S rDNA-Sequenzierung identifiziert. M. oxydans war mit Abstand die am häufigsten isolierte Spezies und machte etwa ein Drittel der Stämme aus (9 von 30), gefolgt von M. paraoxydans (5 Stämme); M. aurum und M. lacticum waren jeweils mit 4 Stämmen vertreten. Die verbleibenden acht Stämme verteilten sich auf mehrere Spezies, mit einem M. foliorum-Isolat, einem M. schleiferi-Isolat, einem M. testaceum-Isolat und fünf Isolaten, die keiner beschriebenen Spezies zugeordnet werden konnten.

Obwohl Mikrobakterien nur selten an menschlichen Erkrankungen beteiligt sind, nimmt die Zahl der relevanten Isolate, die in nosokomialen Umgebungen gefunden werden, zu. Obwohl mehr als 30 Spezies in der Gattung anerkannt sind, ist es wahrscheinlich, dass nur eine begrenzte Anzahl von ihnen aus klinischen Proben isoliert wird. Eine genauere Identifizierung von Humanisolaten könnte uns helfen, besser zu verstehen, welche Arten dazu neigen, opportunistische Krankheitserreger zu werden.