Im Jahr 1775 kehrte Biddle nach Nordamerika zurück, um dem Staat Pennsylvania seine Dienste im Kampf gegen die britische Herrschaft anzubieten. Mit dem Ausbruch des Amerikanischen Revolutionskriegs übertrug der Sicherheitsausschuss von Pennsylvania Biddle das Kommando über die bewaffnete Galeere Franklin. Im Dezember 1775 wurde Biddle in die kontinentale Marine aufgenommen und zum Kapitän der 14-Kanonen-Brigade Andrew Doria ernannt.

Biddle nahm an der Expedition gegen New Providence teil und kämpfte am 6. April 1776 in der Aktion der kontinentalen Marine gegen die HMS Glasgow. Biddle äußerte sich sehr kritisch über die Aktion und merkte an, dass die fehlende Signalisierung durch Kommodore Esek Hopkins zu einem „hektischen“ Gefecht führte. Später nahm Biddle an einer Kreuzfahrt durch die Neufundlandbänke teil, die so erfolgreich war, dass er bei seiner Rückkehr in den Hafen nur noch fünf Matrosen an Bord seines Schiffes hatte; der Rest besetzte die während der Fahrt erbeuteten Schiffe.

Am 6. Juni 1776 wurde Biddle vom Kontinentalkongress zum Kommandanten der Randolph ernannt, einer Fregatte mit 32 Kanonen, die damals in Philadelphia gebaut wurde. Sie lief gegen Ende des Jahres vom Stapel und stach Anfang 1777 in See. Im September 1777 kaperte Biddle die HMS True Briton und ihren aus drei Schiffen bestehenden Konvoi.

Am 7. März 1778 kämpfte die Randolph vor Barbados gegen das britische Linienschiff HMS Yarmouth mit 64 Kanonen. Anstatt zu versuchen, vor dem schwerer bewaffneten Gegner zu fliehen, nahm Randolph den Kampf auf, um einen amerikanischen Handelskonvoi zu schützen. Ein Augenzeuge berichtete, die Fregatte habe sich in dem zwanzigminütigen Gefecht gut behauptet und „vier oder fünf Breitseiten auf die Yarmouth abgefeuert, die nur eine hatte“. Nachdem Biddle verwundet worden war, explodierte die Randolph plötzlich und tötete alle bis auf vier der 305 Personen an Bord, einschließlich Biddle. Der Verlust von Randolph war ein schwerer Schlag für die noch junge kontinentale Marine. Sein Leichnam ging auf See verloren und wurde nie geborgen.

Sein Bruder Edward Biddle war ein überzeugter Verfechter der amerikanischen Unabhängigkeit, und sein Neffe Nicholas Biddle war ein angesehener Bankier.

Vier Schiffe der United States Navy wurden ihm zu Ehren USS Biddle genannt.

Cyrus Townsend Bradys Buch For Love of Country basiert teilweise auf dem Leben von Nicholas Biddle.