Morpholino-Oligos sind fortschrittliche Werkzeuge zum Blockieren von Stellen auf RNA, um zelluläre Prozesse zu behindern. Ein Morpholino-Oligo bindet spezifisch an die ausgewählte Zielstelle und blockiert so den Zugang von Zellkomponenten zu dieser Zielstelle. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um die Translation zu blockieren, das Spleißen zu blockieren, miRNAs oder ihre Ziele zu blockieren und die Aktivität von Ribozymen zu blockieren.
Translationsblockierung: Durch die sterische Blockierung des Translationsinitiationskomplexes können Morpholinos die Expression vieler Zielsequenzen so weit unterdrücken, dass nach dem Abwarten des Abbaus des vorhandenen Proteins die Bande des Zielproteins aus den Western Blots verschwindet. Im Gegensatz zu vielen Antisense-Typen (z. B. siRNA, Phosphorothioate) bewirken Morpholinos im Allgemeinen keinen Abbau ihrer RNA-Ziele; stattdessen blockieren sie die biologische Aktivität der Ziel-RNA, bis diese RNA auf natürliche Weise abgebaut wird, wodurch das Morpholino freigesetzt wird. Dies bedeutet, dass die RT-PCR nicht geeignet ist, um die Blockierung der Translation durch Morpholinos zu testen.
Spleißblockierung: Durch die Blockierung von Stellen, die am Spleißen von prä-mRNA beteiligt sind, können Morpholinos zur Veränderung und Kontrolle normaler Spleißvorgänge eingesetzt werden. Diese Aktivität kann bequem durch RT-PCR getestet werden, wobei eine erfolgreiche Spleißmodifikation als Veränderung der RT-PCR-Produktbande auf einem elektrophoretischen Gel erscheint. Die Bande kann sich zu einer neuen Masse verschieben oder, wenn die Spleißmodifikation einen Nonsense-vermittelten Zerfall des Transkripts auslöst, verliert die wild gespleißte Bande an Intensität oder verschwindet.
Wie alle Gen-Knockdown-Reagenzien müssen Morpholinos aktiv in die meisten Zellen eingebracht werden. Morpholinos können durch verschiedene Methoden in kultivierte Zellen eingebracht werden, z. B. durch Scrape-Loading von adhärenten Zellen, Elektroporation und sogar Mikroinjektion. Unser Endo-Porter-Verabreichungsreagenz bietet jedoch im Allgemeinen eine hervorragende Verabreichung in kultivierten Zellen, was die Menge des pro Zelle verabreichten Morpholinos, die gleichmäßige Verteilung in einer Zellpopulation, die Reproduzierbarkeit der Verabreichung und die Nichttoxizität für die meisten Zelltypen bei der empfohlenen Konzentration betrifft. Bei Tierversuchen dringen unsere Vivo-Morpholinos mit ihrer angehängten Verabreichungseinheit nach i.v.-Verabreichung in Zellen aus dem Blut ein oder dringen in Zellen in Geweben ein, die lokale Injektionen umgeben; sie sind auch die bequemsten Antisense-Oligos für die Verwendung in Zellkulturen oder Explantaten, da sie kein zusätzliches Mittel für die zytosolische Verabreichung benötigen.
Ein Morpholino-Oligo unterscheidet sich grundlegend von natürlichen Nukleinsäuren, wobei Methylenemorpholin-Ringe die Ribose- oder Desoxyribose-Zuckerbestandteile und nicht-ionische Phosphorodiamidat-Bindungen die anionischen Phosphate von DNA und RNA ersetzen. Jeder Morpholinring positioniert eine der Standard-DNA-Basen (A, C, G, T) in geeigneter Weise für die Paarung, so dass ein 25-Basen-Morpholino-Oligo stark und spezifisch an seine komplementäre 25-Basen-Zielstelle in einem RNA-Strang über Watson-Crick-Paarung bindet. Da das ungeladene Grundgerüst des Morpholino-Oligos von Enzymen nicht erkannt wird, ist es gegenüber Nukleasen völlig stabil.
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- Überprüfung der Übertragung
- Löslichkeit und Morpholinos
Wie bei allen Gen-Knockdown-Agenzien ist die effektive Übertragung von Morpholinos entscheidend. Während es bei Experimenten mit embryonaler Mikroinjektion nicht entscheidend ist, ob die Morpholinos auch wirklich ankommen, ist dies bei Experimenten mit kultivierten Zellen wichtig. Unser Endo-Porter-Transportreagenz ermöglicht im Allgemeinen einen einfachen und zuverlässigen Transport für die meisten Zelltypen. Mit einem fluoreszenzmarkierten Morpholino können Sie feststellen, ob es gut in das Zytosol Ihrer Zellen gelangt. Wir empfehlen Ihnen, zu diesem Zweck unser kostengünstiges Fluorescein-gekennzeichnetes Standard-Kontroll-Oligo zu verwenden.
Wenn Sie ein fluoreszierendes Morpholino verwenden, um die Übertragung zu bestätigen, beginnen Sie mit einer Konzentration von 10 mikroMol Morpholino-Oligo im Kulturmedium. Diese Konzentration ist so hoch, dass das fluoreszierende Morpholino nach 16 Stunden im Zytosol durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar sein sollte. Ein inverses Fluoreszenzmikroskop ist die beste Wahl für die Beobachtung von Zellen in Kulturplatten. Beobachten Sie lebende (unfixierte) Zellen. Verwenden Sie ein Trockenobjektiv mit der höchsten verfügbaren numerischen Apertur, um so viel Licht wie möglich von den Zellen aufzufangen. Eine erfolgreiche Abgabe zeigt sich durch eine diffuse Fluoreszenz im gesamten Zytosol. Punktförmige Fluoreszenz deutet in der Regel darauf hin, dass das Oligo in Endosomen gefangen ist. Ignorieren Sie also punktförmige Flecken und achten Sie auf die diffuse Fluoreszenz.
Für tatsächliche Experimente, bei denen Sie Ihre maßgeschneiderte Morpholino-Sequenz mit Endo-Porter freisetzen, benötigen Sie im Allgemeinen eine Konzentration von nur 1 bis 5 mikroMolar für eine effektive sterische Blockierung der meisten mRNAs.
Obwohl Morpholino-Oligos viel löslicher sind als andere nicht-ionische Strukturtypen (wie PNAs), haben einige Morpholinos mit hohem G-Gehalt (>30%) eine begrenzte Löslichkeit. Auch das Anhängen unseres rot-emittierenden Lissamin-Fluors verringert manchmal die Löslichkeit des Oligos. Die Löslichkeit variiert mit der Oligosequenz und ist schwer vorherzusagen. Die nachstehenden Empfehlungen können dazu beitragen, die Oligoaktivität aufrechtzuerhalten, wenn Ihre Sequenz eine schlechte Löslichkeit aufweist.
Für eine langfristige Lagerung werden Ihre Morpholino-Stammlösungen am besten gefriergetrocknet gelagert, die nächstbeste Wahl ist die Lagerung in Lösung bei Raumtemperatur. Die Herstellung von Morpholino-Stammlösungen bei oder unter 1 milliMolar hilft, Löslichkeitsprobleme zu vermeiden. Gefrier-Auftau-Zyklen oder langfristige Lagerung bei 4°C können zur Ausfällung oder Assoziation der Morpholinos führen und die Aktivität der Lösung verringern. Wir empfehlen die Lagerung bei Raumtemperatur in dicht verschlossenen Behältern, und um Verdunstung im Falle einer fehlerhaften Versiegelung des Fläschchens zu vermeiden, ist es ratsam, die Vorräte in einer feuchten Umgebung wie einem Humidor zu lagern (z. B. in einer Glasglocke mit einem offenen Becher mit Wasser). Achten Sie darauf, dass das Oligo nicht austrocknet, da es schwierig oder unmöglich sein kann, ein ausgetrocknetes Oligo wieder aufzulösen (gefriergetrocknete Oligos lösen sich jedoch relativ leicht auf). Es empfiehlt sich, das Fläschchen in einer dunklen Kiste aufzubewahren oder in Folie einzuwickeln, da fluormarkierte Oligos im Licht photobleach werden können.
Aggregation in der Lösung kann mit der Zeit zu einer Abnahme der biologischen Aktivität führen, was bei Lösungen, die bei Raumtemperatur gelagert werden, vorkommen kann. Dies kann in einigen Fällen durch 5-minütiges Erhitzen bei 65 °C oder in den meisten Fällen durch Autoklavieren (Flüssigkeitszyklus verwenden) rückgängig gemacht werden. Die Oligonukleotide sind sehr hitzestabil und können mehrere Autoklaviervorgänge vertragen, ohne dass es zu einem Abbau kommt. Oft kann durch Autoklavieren ein Bestand wiederbelebt werden, der aufgrund von Oligo-Aggregation an Aktivität verloren hat.
DNA, RNA und die meisten Gen-Knockdown-Reagenzien werden während der Experimente normalerweise in einem Eisbad gelagert, um den Abbau durch Nukleasen zu minimieren. Da Morpholinos völlig resistent gegen enzymatischen Abbau sind und wässrige Lösungen bei Raumtemperatur unbegrenzt (Jahre) chemisch stabil sind, empfehlen wir Ihnen, Ihre Stammlösungen von Morpholinos während Ihrer Experimente bei Raumtemperatur aufzubewahren. Wenn Sie Ihre Stammlösungen in einem Eisbad abkühlen, besteht lediglich die Gefahr, dass das Morpholino ausfällt.
Diese Vorsichtsmaßnahmen sind für die meisten Sequenzen mehr als notwendig, aber ihre routinemäßige Anwendung hilft, unangenehme Überraschungen zu vermeiden, falls Sie auf eine Sequenz mit geringer Löslichkeit stoßen.