Einführung

4-Hydroxy-l-Prolin (Hydroxyprolin) ist eine nicht-proteinogene Aminosäure, die ein Molekulargewicht von 131,13 g/Mol hat und durch posttranslationale Hydroxylierung von Prolin während der Kollagenbiosynthese synthetisiert wird (Abb. 1). Bei der Untersuchung des physiologischen und pathologischen Kollagenstoffwechsels werden in der Regel Messungen von Hydroxyprolin im Plasma, Urin und Körpergewebe durchgeführt. Daher liefert die Bestimmung von Hydroxyprolin nützliche Informationen für die Diagnose und Prognose von Krankheiten, die durch Störungen des Kollagenstoffwechsels verursacht werden (1). Zu diesen Erkrankungen gehören Hyperthyreose, Hyperparathyreoidismus, Akromegalie, Morbus Paget, Osteomalazie, Rachitis, Marfan-Syndrom, Osteogenesis imperfecta, Sklerodaktylie, Dermatomyositis und Cushing-Syndrom (2).

Fibrose, die in Leber, Lunge, Nieren, Haut und anderen Organen auftritt, kann sich zu chronischer Leberentzündung, Lebersklerose, Leberkrebs, Lungenfibrose und Glomerulonephritis entwickeln (3). Daher ist es äußerst wichtig, die Entwicklung einer Fibrose bei Patienten zu verhindern und ihren Schweregrad zu verringern. Hydroxyprolin ist ein wichtiger diagnostischer Indikator für den Schweregrad der Fibrose.

Die Messung von Hydroxyprolin in Plasma, Urin und Körpergewebe ist mit kolorimetrischen Methoden, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Fließinjektionsanalysen möglich (4-6). Diese Methoden erfordern jedoch aufgrund ihrer geringen Empfindlichkeit große Probenmengen. Darüber hinaus erfordert die HPLC eine lange Trennungszeit für jede Probe. In den letzten Jahren hat sich die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und kurzen Trennzeit als vorteilhaft erwiesen. LC-MS wurde zur Messung niedriger Konzentrationen von Drogen im Serum und Urin mit verunreinigten Substanzen eingesetzt (7-9). Ziel der vorliegenden Studie war es, die neuartige LC-MS-Methode zur Messung von Hydroxyprolin anzuwenden. Als Indikator für Fibrose wurde Hydroxyprolin in Leber und Lunge eines Rattenmodells für Fibrose mittels LC-MS gemessen und mit früheren Ergebnissen verglichen, die mit HPLC- und kolorimetrischen Methoden erzielt wurden.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Harbin (Harbin, China) genehmigt. Das Protokoll enthielt ein Standardverfahren zur Einholung der schriftlichen Einwilligung nach Aufklärung und wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Harbin genehmigt.

Reagenzien

Dimethylnitrosamin (DMN) und Hydroxyprolin wurden von Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japan). Nembutal wurde von Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japan) und Bleomycin wurde von Nihon Kayaku Inc. (Tokio, Japan). Alle anderen Chemikalien waren von Reagenzienqualität.

Herstellung eines Modells der Lungen- und Leberfibrose bei Ratten

Ein Modell der Lungenfibrose wurde bei fünf Wochen alten Wistar-Ratten durch Injektion von Bleomycin (BLM, 0,30U/100 g, i.Gesunden Ratten wurde 0,9 %ige Kochsalzlösung (Kontrolle) injiziert.

Ein Modell der Leberfibrose wurde bei fünf Wochen alten Wistar-Ratten durch eine einmalige Injektion von DMN (40 mg/kg, i.p.) erzeugt. Normale, gesunde Ratten dienten als Kontrollen und wurden mit 0,9%iger Kochsalzlösung (Kontrolle) injiziert. Die Vorbereitung des Lungenfibrosemodells und des Sammelgewebes basierte auf den in früheren Studien (10,11) beschriebenen Methoden.

Messung von Hydroxyprolin in einem Rattenmodell der Lungenfibrose durch eine kolorimetrische Methode

Die linke Lunge wurde entfernt, gewogen (~0.Die linke Lunge wurde entnommen, gewogen (~0,3 g) und in 5%iger Trichloressigsäurelösung (x10 Volumen) mit einem Zellhomogenisator (Eilard, Berlin, Deutschland) bei 8.000 × g (4°C) für 2 min im Eisbad homogenisiert. Die Zellen wurden 20 Minuten lang zentrifugiert (2.500 × g, 4°C) und der Überstand zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurde 6 N HCl bei 110°C zu Beginn vollständig zugegeben und 16 h lang umgesetzt. Nach Abschluss der Reaktion wurde Toluol (3 ml) zugegeben und die Mischung 20 min lang geschüttelt. Nach 10-minütiger Zentrifugation (3.000 × g, 20°C) wurde die organische Schicht abgetrennt und p-Dimethylaminobenzaldehyd zugegeben. Hydroxyprolin in der Probe wurde mit einem Multiplate-Spektrometer (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bei 560 nm nachgewiesen.

Messung von Hydroxyprolin in der Leber mittels HPLC

Die linke Lunge wurde entnommen, gewogen (~0,3 g) und in 5 ml Ethanol mit einem Zellhomogenisator (Eilard) bei 8.000 × g (4°C) für 2 min in einem Eisbad homogenisiert. Das Homogenisat wurde 20 min lang zentrifugiert (2.500 × g, 4°C) und der Überstand gesammelt. Die gewonnene Flüssigkeit (1 ml) wurde 8 Stunden lang bei 60 °C bis zur Trocknung erhitzt. Nach Auflösen des Rückstands in 40 μl Ethan und 80 μl Boratpuffer (0,1 M, pH 8) wurden 40 μl4-Fluor-7-nitrobenzofurazan (100 mM) als Fluoreszenzreagenz zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden lang im Dunkeln durchgeführt. Dann wurden 840 μl Salzsäure (6 mol/l) zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Nach 20-minütiger Zentrifugation (2.500 × g, 20°C) wurde der Überstand für die HPLC-Analyse abgenommen.

Es wurde ein Hitachi L6000 HPLC-System (Hitachi High-Technologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA) verwendet.Die Detektion erfolgte mit einem Hitachi L7480 Fluoreszenzspektrometer (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japan; Anregung bei 475 nm, Emission bei 530 nm). Die Säule (HitachiHigh-Technologies Corporation) war ein YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) bei Raumtemperatur. Die mobile Phase war Acetonitril: Wasser (35:65-50:50 Gradient über 15 min) und die Flussrate betrug 1 ml/min.

Messung von Hydroxyprolin in Lungen- und Leberorganisation durch LC-MS

Die linke Lunge wurde entfernt, gewogen (~0.Die linke Lunge wurde gewogen (~0,3 g) und in 5%iger Trichloressigsäurelösung (x10 Volumen) mit einem Zellhomogenisator (Eilard) bei 8.000 × g (4°C) für 2 min in einem Eisbad homogenisiert. Die Zellen wurden 20 Minuten lang zentrifugiert (2.500 × g, 4°C). Der Supernatant wurde zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurde 6 N HCl bei 110°C für 16 h zugegeben und die Proben wurden für die Messung vorbereitet. Die Leber wurde entnommen, gewogen (~0,3 g) und in 5 ml Ethanol mit einem Zellhomogenisator (Eilard) bei 8.000 × g (4°C) für 2 min in einem Eisbad homogenisiert. Das Homogenisat wurde 20 Minuten lang zentrifugiert (2.500 × g, 4°C), der Überstand aufgefangen und die Proben für die Messung vorbereitet.

Die Konzentration von Hydroxyprolin wurde nach einer LC-MS-Methode mit einem LC-MS2020-System (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) bestimmt. Bei der LC-Methode war die mobile Phase 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. Die Säule war Shin-pack VP-ODS (150×2 mm Durchmesser). Die Flussrate betrug 0,2 ml/min. Für die MS wurde die atmosphärische chemische Ionisierung (APCI) verwendet. Es wurde auch eine positive Ionendetektion verwendet. Die Sondenelektronenspannung betrug 4,5 kV und der Sondenstrom 4,2 μA. Die Temperatur der APCI-Sonde betrug 250 °C und die Elektronenspannung der gekrümmten Desolvationslinie (CDL) -30,0 V. Die CDL-Temperatur betrug 250 °C und die Blocktemperatur 20 °C. Die Vorspannung für die Q-Arrays 1, 2 und 3 betrug 5,0, 25,0 bzw. 35,0 V. Die HF-Elektronenspannung des Q-Arrays betrug 150,0 V.

Statistische Analyse

Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine einseitige Varianzanalyse untersucht. Wenn ein signifikanter Unterschied festgestellt wurde, wurde der Unterschied zwischen den Gruppen mit der Bonferroni-Methode untersucht. Die Korrelationen wurden mit einem zweiseitigen t-Test untersucht. P<0,05 wurde als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied gewertet.

Ergebnisse

Messung der Hydroxyprolin-Konzentration mittels LC-MS

MS-Chromatogramm von Hydroxyprolin

Das Massenspektrum von Hydroxyprolin ist inAbb. 2 dargestellt. Die MS des Hydroxyprolin-Standards (80 pg/ml) ergab Fragment-Peaks mit einer Molekülmasse von 173,0 (Molekül-Ion + Essigsäure-Wasser), die durch Zugabe von Essigsäure-Ammonium zur Erhöhung der Anzahl der Ionenmoleküle (Molekülmenge, 131,15) und der Ionenstärke erzeugt wurden.

LC-MS-Chromatogramm von Hydroxyprolin

Die LC-Bedingungen waren wie folgt: Mobile Phase, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; Säule, Shin-pack VP-ODS (150×2 mm Durchmesser); Flussrate, 0,2 ml/min und Ultraviolett (UV)-Detektion bei 230 nm. Die MS wurde mit derAPCI-Ionisierungsmethode durchgeführt, und die Ionendetektion war positiv.

Das LC-MS-Chromatogramm von Hydroxyprolin (m/z, 173,0) ist in Abbildung 3 dargestellt. Wie beim Hydroxyprolin-Standard wurde ein Peak bei 1 ng/ml mit einer Retentionszeit von 2,213 min beobachtet. Ein scharfer Peak wurde auch bei 50 ng/ml beobachtet. Bei 1 μg/ml, was dem 1.000-fachen der Standardkonzentration entspricht, wurde im LC-UV-Spektrum (230 nm) ein kleiner Peak festgestellt.

Empfindlichkeit der LC-MS-Detektion von Hydroxyprolin

Die LC-MS-SIM-Standardkurve von Hydroxyprolin (m/z, 173,0; Molekülion + Essigsäure-Wasser) ist in Abb. 4 dargestellt. Bei Verwendung der Peakflächenmethode für die Standardkurve zeigte Hydroxyprolin einen scharfen Peak bei 35ng/ml (Abb. 3). Bei Konzentrationen <35 ng/ml wurde jedoch keine Korrelation zwischen den Peakflächen beobachtet. Von 35-560 ng/ml wurde eine Korrelation zwischen den Peakflächen beobachtet, und die Standardkurve war eine gerade Linie. Bei 60 und 80 μg/ml waren die Peakflächen fast identisch. Bei Konzentrationen >60 μg/ml wurde keine Korrelation zwischen den Peakflächen beobachtet.

LC-MS-Chromatogramm und MS-Spektrum von Hydroxyprolin in einem Modell der Lungen- und Leberfibrose bei Ratten

Abbildung 5 zeigt dasLC-MS-Chromatogramm und MS-Spektrum mit SIM-Detektion von Hydroxyprolin (m/z 173,0; Molekülion + Essigsäure-Wasser) in einem Lungenfibrosemodell bei Ratten. Im LC-MSchromatogramm der Lunge wurde, ähnlich wie beim Hydroxyprolin-Standard, ein deutlicher Peak bei m/z 173,0 bei einer Verweilzeit von 2.213 min beobachtet. Hydroxyprolin wurde bei m/z 131,15 im Massenspektrum identifiziert.

Abbildung 6 zeigt das LC-MS-Chromatogramm und das MS-Spektrum mit SIM-Nachweis von Hydroxyprolin (m/z 173,0; Molekularion + Essigsäure-Wasser) im fibrotischen Lebergewebe von Ratten. Wie beim Hydroxyprolin-Standard wurde im LC-MS-Chromatogramm und MS-Spektrum ein Peak bei einer Retentionszeit von 2,213 min festgestellt.

Hydroxyprolin-Konzentration im Lungengewebe (kolorimetrische und LC-MS-Methoden)

Kolorimetrische und LC-MS-Methoden, die zur Bestimmung der Hydroxyprolin-Konzentration im Lungengewebe von Ratten eingesetzt wurden, werden in Abb. 7 verglichen. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von neun Versuchen dar. Nach der kolorimetrischen Methode war die Hydroxyprolin-Konzentration im Lungengewebe von Ratten in der BLM-infundierten Gruppe (652,3±70,0 μg/linke Lunge) signifikant höher als in der Kontrollgruppe (547,1±52,3 μg/linke Lunge; P<0,05). Nach der LC-MS-Methode hatte die BLM-infundierte Gruppe (610,9±50,3 μg/linke Lunge) einen signifikant höheren Wert als die Kontrollgruppe (493,3±53,5 μg/linke Lunge; P<0,05).Die mit der LC-MS-Methode gemessene Hydroxyprolin-Konzentration im Lungengewebe der Ratten hatte jedoch einen niedrigeren Wert als die mit der kolorimetrischen Methode gemessene.

Die mit der kolorimetrischen und der LC-MS-Methode gemessenen Hydroxyprolin-Konzentrationen im Lungengewebe der Ratten werden in Abb. 8 verglichen. Es wurde eine Korrelation zwischen der kolorimetrischen und der LC-MS-Methode für die Bestimmung der Hydroxyprolin-Konzentration im Lungengewebe der Kontrollgruppe festgestellt (r=0,972). Ebenso wurde eine Korrelation zwischen der kolorimetrischen und der LC-MS-Methode für die Bestimmung der Hydroxyprolin-Konzentration im Lungengewebe der BLM-infundierten Gruppe festgestellt (r=0,918).

Hydroxyprolin-Konzentration in Rattenlebergewebe durch Fluoreszenzmarkierung und LC-MS-Methoden

Die Bewertung der Hydroxyprolin-Konzentration in Rattenlebergewebe durch Fluoreszenzmarkierung und LC-MS-Methoden ist in Abb. 9 dargestellt. Nach der Fluoreszenzmarkierungsmethode war die Hydroxyprolin-Konzentration im Rattenlebergewebe der DMN-infundierten Gruppe (105,4±36,5 μg/g) signifikant höher als die der Kontrollgruppe (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). Auch nach derLC-MS-Analyse wies die DMN-infundierte Gruppe (190,4±70,3 μg/g) einen signifikant höheren Wert auf als die Kontrollgruppe (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Die durch LC-MS gemessene Hydroxyprolin-Konzentration im Rattenlebergewebe war jedoch höher als die durch die Fluoreszenzmarkierungsmethode gemessene.

Die durch Fluoreszenzmarkierung und LC-MS-Methoden gemessene Hydroxyprolin-Konzentration im Rattenlebergewebe ist in Abb. 10 korreliert. Die durch Fluoreszenzmarkierung ermittelte Hydroxyprolin-Konzentration im Lebergewebe der Kontrollgruppe korrelierte mit der durch die LC-MS-Methode ermittelten Konzentration (r=0,957). Auch die Hydroxyprolin-Konzentration im Lebergewebe der DMN-infundierten Gruppe, die mit der Fluoreszenzmarkierungsmethode ermittelt wurde, korrelierte mit derjenigen, die mit der LC-MS-Methode ermittelt wurde (r=0,981).

Diskussion

Hydroxyprolin ist eine Art von Aminosäure, die in Albumen vorkommt. Der Prolinrest im Protein wird von der 4-Monooxgenase hydroxyliert, um 4-Hydroxy-2-oxoglutalsäure zu bilden, die im menschlichen Körper über 4-Glutaminsäure zu Alanin und Glycin umgewandelt wird. In jedem inneren Organ des Körpers können Entzündung und Fibrose zu einer Anhäufung von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (ECM) führen (12). Unter pathologischen Bedingungen kann es jedoch zu einer zusätzlichen Fibrose in Leber, Lunge und Nieren kommen (13,14).Chronische Hepatitis und Lebersklerose sind mit Fibrose verbunden und stehen in engem Zusammenhang mit Leberkrebs (15).

In der Lunge hängt der Schweregrad der Fibrose von der Art der Lungenentzündung ab (16).In der Regel geht die Lungenfibrose mit einer interstitiellen Lungenentzündung einher(17). Die Fibrose in inneren Organen wird durch die Proliferation von ECM-Komponenten verursacht, die von Myofibroblasten abgelagert werden. Um die Entwicklung der Fibrose zu verstehen, ist die Untersuchung der Kollagenkonzentration erforderlich. Die Hydroxyprolinkonzentration wird mit dem Kollagen als Indikator für das Ausmaß der Fibrose in Verbindung gebracht (18-20). Hydroxyprolin ist ein wichtiger Indikator für Krankheiten, die durch Kollagenwucherungen (wie Infibrose) und Stoffwechselstörungen verursacht werden.

In den letzten Jahren hat sich die LC-MS als hochempfindliche Nachweismethode erwiesen (7,8,21).Die LC-MS besteht aus einer LC- und einer MS-Komponente sowie einer Schnittstelle, die sie miteinander verbindet. Der LC-Teil ist identisch mit der herkömmlichen HPLC. Die Probe wird durch den Interface-Teil ionisiert. Die Thermospray-Ionisierung führte zu instabilen (flüchtigen) Produkten, so dass APCI verwendet wurde (das Material, nicht aber das Lösungsmittel, wird nach der Vernebelung mit dem Lösungsmittel unter Atmosphärendruck ionisiert). Die Elektrospray-Ionisierung (ESI) kann zur Ionisierung von Molekülen mit hoher Polarität und hohem Molekulargewicht verwendet werden, was sich ideal für die Grenzflächenkomponente eignet. In der vorliegenden Studie wurde die ESI jedoch nicht für die Messung von Hydroxyprolin in Körperproben eingesetzt, da die ESI im Falle der Ionisierung nicht vom Thermospray begleitet wurde. Ein einfacheres Verfahren war die Messung von Hydroxyprolin in Kombination mit Na+ durch Zugabe von zusätzlichem Na+ zur Probe.

Das MS-Spektrum von Hydroxyprolin zeigte Peaks von m/z 173,0 und 131,15. m/z 173,0 wurde als Peak identifiziert, der das Essigsäuresalz repräsentiert, das von dem Essigsäureammonium stammt, das der mobilen Phase zur Erhöhung der Ionenstärke zugesetzt wurde. Da die Vergleichsstärke von m/z 131.15 und 173.0 im MS-Spektrum annähernd identisch ist, wurde das Ion m/z 173.0 im MS-Chromatogramm von SIM ausgewählt, um den Störpeak der mobilen Phase zu vermeiden.

Im MS-Chromatogramm des Hydroxyprolin-Standards bei 1 ng/ml wurde bei der SIM-Messung ein Peak mit m/z 173.0 beobachtet. Im UV-Spektrum (230 nm) von Hydroxyprolin bei 1 μg/ml, was dem 1.000-fachen der Standardkonzentration entspricht, wurde ein kleiner Peak beobachtet (die Messung wurde zur gleichen Zeit wie die LC-Messung durchgeführt).

Bei Konzentrationen <35 ng/ml wurde unter den Peakbereichen keine starke Korrelation zwischen den verschiedenen Methoden beobachtet, und es war nicht möglich, eine Standardkurve zu erstellen. Es wurde vermutet, dass der Analyt durch den Peak der mobilen Phase beeinflusst worden sein könnte, da Hydroxyprolin ein vergleichsweise geringes Molekulargewicht (131,15) aufweist. Außerdem könnte die Peak-Retentionszeit aufgrund der Polarität des Lösungsmittels bei niedrigen Konzentrationen (Hydroxyprolin-Konzentration <35 ng/ml) instabil geworden sein.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass es möglich sein könnte, Konzentrationen von Substanzen bis hinunter zum pg/ml-Niveau zu messen. Für den Peak von Hydroxyprolin im MS-Chromatogramm war die Retentionszeit kurz (2,213 min). Die relative Ionenstärke im MS-Spektrum bei m/z 131,15 und 173,0 war ungefähr identisch, und dementsprechend wählte der Interferenzpeak der mobilen Phase ein Ion von m/z 173,0. Im LC-MS-Chromatogramm von Hydroxyprolin in Lungen- und Lebergewebe wurde bei einer Verweilzeit von 2,213 min ein scharfer Peak von m/z 173,0 beobachtet, genau wie beim Hydroxyprolin-Standard. Im MS-Spektrum wurde der Molekül-Ionen-Peak von Hydroxyprolin (m/z 131,15) bestätigt.

Die Messung der Hydroxyprolin-Konzentration in Lungen- und Lebergewebe mittels LC-MS wurde mit den Ergebnissen der kolorimetrischen Methode sowie einer Fluoreszenzmethode mittels HPLC aus einer früheren Studie unserer Gruppe verglichen. Es wurde eine hoch signifikante positive Korrelation festgestellt. Allerdings war der mit der kolorimetrischen Methode ermittelte Wert der Hydroxyprolin-Konzentration in der Lunge höher als der mit der LC-MS ermittelte. Außerdem war die Hydroxyprolin-Konzentration in der Leber, die mit der Fluoreszenzmethode unter Verwendung von HPLC ermittelt wurde, niedriger als der mit LC-MS ermittelte Wert (bei dem von einer hohen Absorption aller Komponenten in der Probe bei einer konstanten Wellenlänge von 560 nm ausgegangen wurde).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Hydroxyprolin als Indikator für Fibrose in früheren Studien unserer Gruppe mit kolorimetrischen und HPLC-Methoden gemessen wurde. Im Vergleich dazu wurde in der vorliegenden Studie festgestellt, dass die LC-MS-Methode vorteilhafter ist, da sie sich durch ein einfaches Verfahren, hohe Empfindlichkeit (pg-Wert) und kurze Trennzeiten auszeichnet. Weitere Untersuchungen mit größeren Probenmengen sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen.

Acknowledgements

Die Autoren danken M. Kusunose, M. Ono undA. Hamada (Department of Pharmacy, Kochi Medical School, Kochi, Japan) für die Bereitstellung verschiedener Reagenzien, die in dieser Studie verwendet wurden, sowie für hilfreiche Anregungen und technisches Fachwissen. Diese Arbeit wurde von der Abteilung für öffentliche Gesundheit der Provinz Heilongjiang (Nr. 2013365) in China finanziert.

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