Metyrapon kann bei der Diagnose einer Nebenniereninsuffizienz eingesetzt werden. Metyrapon 30 mg/kg, Höchstdosis 3.000 mg, wird um Mitternacht in der Regel zusammen mit einem Snack verabreicht. Das Plasmacortisol und 11-Desoxycortisol werden am nächsten Morgen zwischen 8.00 und 9.00 Uhr gemessen. Ein Plasmacortisol von weniger als 220 nmol/l zeigt eine ausreichende Hemmung der 11β-Hydroxylase an. Bei Patienten mit intakter Hypothalamo-Hypophysen-Nebennieren-Achse steigen die CRH- und ACTH-Spiegel als Reaktion auf die sinkenden Cortisolspiegel an. Dies führt zu einem Anstieg der Steroidvorstufen im Stoffwechselweg. Wenn also der 11-Desoxycortisolspiegel nicht ansteigt und unter 7 µg/dl (202 nmol/l) bleibt und das adrenocorticotrope Hormon (ACTH) ansteigt, ist dies ein deutlicher Hinweis auf eine Nebenniereninsuffizienz. Wenn weder 11-Desoxycortisol noch ACTH ansteigen, ist dies ein deutlicher Hinweis auf eine gestörte Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse entweder in der Hypophyse oder im Hypothalamus.

Metyrapon-Test kann bei der Überprüfung der Ursache des Cushing-Syndroms helfen. Die meisten Patienten mit Hypophysenfunktionsstörungen und/oder Hypophysenmikroadenomen erhöhen die ACTH-Sekretion als Reaktion auf Metyrapon, während die meisten ektopischen ACTH-produzierenden Tumoren dies nicht tun. Hypophysenmakroadenome sprechen nicht immer auf Metyrapon an.

Metyrapon wird zur medikamentösen Kontrolle des Hyperkortisolismus beim Cushing-Syndrom (ACTH-abhängig oder unabhängig) eingesetzt. Ziel der medikamentösen Behandlung ist die präoperative Kontrolle des Hyperkortisolismus oder die Kontrolle der nach einer Operation (TSS, Adrenalektomie) fortbestehenden Resterkrankung. Es dient nicht der langfristigen definitiven Behandlung/Heilung, sondern nur als Zusatztherapie (bei den meisten Ursachen des Cushing-Syndroms ist eine Operation das Ziel der Heilung). Metyrapon wirkt also durch Hemmung der Steroidogenese in der Nebenniere. Eine Nebenwirkung ist Hirsutismus (bei Frauen) aufgrund der überschüssigen Androgenvorstufen. Der andere häufig verwendete Wirkstoff zur medizinischen Behandlung des Cushing-Syndroms ist Ketoconazol (ein Mittel gegen Pilzerkrankungen). Bei diesem Mittel tritt die Nebenwirkung des Hirsutismus nicht auf.