Wir haben Glukose-, Glukose- und Glutamin-Nährstoffquellen verwendet, um den Kohlenstofffluss in K562-Zellen und Veränderungen als Reaktion auf die BaP-Behandlung zu entschlüsseln. Insgesamt wurde der größte Teil der Markierung in Riboseeinheiten und Laktat eingebaut (siehe zusätzliche Datei 1: Abbildung S1 für Details zu den Markierungsverteilungen). Wie in Abb. 1 dargestellt, kann man davon ausgehen, dass der Einbau von Markern in den Krebszyklus, der aus Glukose entsteht, zu zwei deutlich unterschiedlichen Markierungsmustern der Metaboliten des Krebszyklus führt, je nachdem, ob das C2-Fragment über die Pyruvatcarboxylase (PC) oder die Pyruvatdehydrogenase (PDH) eintritt. Das aus Glukose gebildete Pyruvat wird über die PDH zu Glutamat, über die PC-Aktivität aber zu Glutamat. Da die PC-Aktivität Oxalacetat aus Pyruvat erzeugt, erwartet man Malat aus PC, während das PDH-Produkt Malat oder Malat sein wird.

NMR-Spektren deuten darauf hin, dass große Mengen von Aspartat und Malat aus PC stammen

Wie in Abb. 2 gezeigt, sind erhebliche Unterschiede zwischen den Zellen zu beobachten. 2 sind signifikante Unterschiede bei den Resonanzen von Malat und Aspartat zwischen Zellen zu erkennen, die 3 bzw. 24 Stunden lang Glukose verarbeiten. Diese Unterschiede äußern sich vor allem in einer Änderung der NMR-Kopplungskonstanten. Die Größe dieser Kopplungskonstanten hängt von der Art des benachbarten Kohlenstoffatoms ab: eine Carbonsäuregruppe ergibt eine viel größere Kopplungskonstante als eine CH2-Gruppe. Die Kopplungskonstante für die 13C1-13C2-Gruppe in Aspartat oder Malat beträgt etwa 50-60 Hz, während die Kopplungskonstante für eine 13C2-13C3-Gruppe etwa 35-40 Hz beträgt.

Für eine 24-stündige Markierungsdauer zeigt Abb. 2 scheinbare Kopplungskonstanten von 53 Hz für C2 von Malat und Aspartat. Diese große scheinbare Kopplungskonstante zeigt, dass die Kopplung von C2 mit der benachbarten C1-Carbonsäuregruppe überwiegt. Dieses 13C1-13C2-Kopplungsmuster (und auch 13C3-13C4, siehe Zusatzdatei 1) ergibt sich aus der PDH-Aktivität und möglicherweise auch aus Metaboliten, die den Krebszyklus bei längerer Markierungsdauer mehrfach durchlaufen.

Für die kurze 3-stündige Markierungsdauer werden kleinere scheinbare Kopplungskonstanten von 47 und 41 Hz für C2 beobachtet (Abb. 2 und Zusatzdatei 1: Abbildung S1), was darauf hindeutet, dass die Kopplung an das benachbarte Methylen C3 dominiert. Das Vorhandensein der 13C2-13C3-Einheit bei kürzeren Markierungszeiträumen zeigt, dass das aus der PC-Aktivität stammende Produkt bei kürzeren Markierungszeiträumen dominiert.

Es ist zu beachten, dass die beobachteten Signalaufspaltungen nicht die genauen skalaren Kopplungskonstanten in einer Mischung markierter Verbindungen darstellen. Dennoch liefert die beobachtete Veränderung einen klaren Hinweis auf höhere Mengen des PC-Produkts bei kürzeren Markierungszeiten sowohl in Malat als auch in Aspartat.

Weiterer Nachweis für PC-Aktivität in Subspektren von Uracil

In der De-novo-Pyrimidinsynthese wird Uracil aus Aspartat über Carbamoyl-Aspartat, Orotat und Dihydroorotat gebildet. Daher sollten sich die Markierungsmuster im Aspartat in den Signalen des Pyrimidinrings widerspiegeln. Zusätzliche Datei 2: Abbildung S2 zeigt die erwarteten Markierungseinbauten für Uracil. Wenn die Uracil-Base in UDP aus Aspartat synthetisiert wird, ist der Bestimmungsort der 13Cs wie folgt: C1, C2 und C3 von Aspartat werden zu C10, C11 bzw. C12 von UDP, während C4 verloren geht (siehe Zusatzdatei 2). In HSQC-Spektren können nur C11 und C12 direkt beobachtet werden, da C10 kein gebundenes Proton hat.

Bei mit Glukose markierten Proben wird das von PC stammende Aspartat mit C2C3 markiert. Dieses wird in der UDP in ein markiertes C11C12-Fragment umgewandelt. Das von der PDH stammende Aspartat kann jedoch an C1C2 oder C3C4 markiert werden. Dies führt zu C10C11 bzw. zu einem isolierten C12 in Uracil. Daher sind die Spektren von C12 ein Indikator für die relativen Mengen an PC- und PDH-Aktivität; PC liefert ein Dublett für C12, während PDH ein Singulett bei C12 liefert.

Alle Spektren zeigten sowohl das Singulett- als auch das Dublettsignal bei C12 (Abb. 3). Die Intensität des Doubletts im Vergleich zum Singulett änderte sich jedoch zwischen 3 und 24 Stunden um den Faktor 3, was wiederum auf eine zeitliche Verschiebung von PC- zu PDH-vermittelter Markierung hinweist. Das Bild, das sich aus mehreren Metaboliten ergibt, ist, dass es eine parallele Aktivität von PC und PDH gibt, aber das PC-Produkt wird in erster Linie in Produkte kanalisiert, die direkt mit Oxalacetat verbunden sind, was zu der hohen Menge an PC-Produkten in diesen Metaboliten bei einer kurzfristigen Exposition führt. Nur bei längeren Markierungszeiten wird das PDH-Produkt im linken Zweig des Krebszyklus beobachtet.

BaP-induzierte Malonat wird von der nachgeschalteten PC-Aktivität in K562-Zellen abgeleitet

Wir haben gezeigt, dass Malonat aus Oxalacetat durch chemische Umwandlung unter dem Einfluss von Wasserstoffperoxid gebildet werden kann, und haben in unserer früheren Studie vermutet, dass die Malonatakkumulation als Reaktion auf die BaP-Behandlung durch die behandlungsinduzierte Erhöhung von ROS, die auf Oxalacetat einwirken, angetrieben wird. Die Proben wurden mit Malonat versetzt, um unsere Zuordnung der Malonat-Methylen-1H/13C-Resonanzen in den HSQC-Spektren zu bestätigen (siehe Zusätzliche Dateien 3 und 4). Wie in Abb. 4a gezeigt, würde man erwarten, dass Malonat, das durch ROS aus Oxalacetat gewonnen wird, das direkt aus Pyruvat durch PC-Aktivität unter Verwendung von Glukose als Nährstoffquelle gebildet wurde, an den Positionen C1 und C2 markiert ist. In der alternativen Situation, dass die PDH-Aktivität Pyruvat bei Eintritt in den Krebszyklus in Acetyl-CoA umwandelt, würde die ROS-vermittelte Umwandlung des resultierenden Oxalacetats in Malonat voraussichtlich zu zwei Produkten mit Markierung in der C1- oder in der C1- und C2-Position in einem 1:1-Verhältnis führen, da der Krebszyklus über symmetrisches Succinat und Fumarat verläuft (siehe auch Abb. 1).

Abbildung 4b zeigt einen repräsentativen 1D-Schnitt aus HSQC-Spektren, die aus 24 Stunden mit BaP behandelten, mit Glukose markierten Zellen stammen, und zeigt deutlich die medikamenteninduzierte Erzeugung eines starken Malonatsignals. In den entsprechenden HSQC-Spektren von 24 Stunden BaP-behandelten glukosemarkierten Zellen beobachteten wir ein deutliches Dublett (Abb. 4c, dargestellt als rote Peaks) mit einer Aufspaltung von 58 Hz, was auf eine markierte CH2-Gruppe hinweist, die an einen Carbonsäure-Kohlenstoff gekoppelt ist. Dies ist ein eindeutiger Hinweis auf ein C1,C2 (oder C2,C3)-markiertes Malonat, bei dem nur eine der beiden Carbonsäuregruppen markiert ist. Bei Malonat, das in allen drei Positionen markiert ist und das möglicherweise aus mehreren Durchläufen durch den Krebszyklus stammt, würde man erwarten, dass es in der 13C-Dimension der HSQC-Spektren ein Triplett am C2-Kohlenstoff aufweist, da zumindest ein gewisser Prozentsatz in beiden COO-Gruppen markiert ist (AX2-Kopplungsmuster). Das Fehlen eines zentralen Signals in der HSQC ist daher ein deutlicher Hinweis darauf, dass Malonat aus einer vorgeschalteten PC-Aktivität stammt. Das Fehlen von Malonat, das aus multiplen Krebszyklen und PDH-Aktivität stammt, wird auch durch die Tatsache gestützt, dass Malonat, das aus der 24-stündigen Markierung von BaP-behandelten Zellen mit Glukose stammt, nur ein Singulett zeigte (Abb. 4c, dargestellt als blauer Peak).

Um weiter zu beweisen, dass arzneimittelinduziertes Malonat stromabwärts von PC-Aktivität stammt, haben wir 13C-1D-Spektren aufgenommen, in denen wir die COO-Resonanzen von Malonat direkt beobachten konnten (Abb. 4d). Ein Referenzspektrum von 10 mM Malonsäure in demselben Puffer (pH 7), der auch für die Zellextrakte verwendet wurde, bestätigte die Frequenz der COO-Resonanz (Abb. 4d).

Bei PC-vermittelter Markierung wird ein Dublett bei C1 (von Malonat) erwartet, während bei PDH-vermittelter Markierung eine 50:50-Mischung aus einem Dublett von Malonat und einem Singulett von Malonat zu erwarten ist (Abb. 4a). Obwohl die abgeleiteten Spektren auch nach 24 Stunden noch verrauscht waren, zeigten sie ein klares Dublett ohne Restsignal in der Mitte (Abb. 4d), was bestätigt, dass das von PC stammende Markierungsprodukt dominant ist. Daraus schließen wir, dass Malonat tatsächlich aus der ROS-vermittelten Umwandlung von Oxalacetat stammt, die vollständig oder zumindest überwiegend von der PC-Aktivität ausgeht, und selbst nach 24 Stunden Markierungszeit keinen Beitrag eines möglichen PDH-Produkts aufweist. Kontrollversuche mit Glutamin als Kohlenstoffquelle zeigten nur einen minimalen Einbau der Markierung in Malonat. Es zeigte sich, dass das aus Glukose hergestellte Malonat überwiegend über PC markiert wird. Zusammengenommen deuten diese beiden Tatsachen stark darauf hin, dass Malonat vorwiegend aus Glukose durch Glykolyse und PC-vermittelten Eintritt von Pyruvat in den TCA-Zyklus gebildet wird.

Beweis für parallele PDH-Aktivität

Tabelle 1 vergleicht die 1 J CC-Kopplungskonstanten und Multiplett-Intensitätsmuster in den 3 und 24 Stunden markierten Datensätzen. Sowohl in den 3- als auch in den 24-Stunden-Datensätzen ist die Markierung an C4 von Glutamat viel größer als die Markierung an C4, und die an C4 beobachtete Aufspaltung deutet auf eine Kopplung an C5 hin. Dies deutet stark darauf hin, dass die PDH-vermittelte Markierung für Glutamat zu beiden Zeitpunkten dominant ist. Das Citrat C2 wird durch eine starke Kopplung an C1 aufgespalten, was ebenfalls stark darauf hindeutet, dass die PDH-vermittelte Markierung dominant ist. Diese Markierungsmuster deuten auf eine klare Dominanz der PDH-Produkte für den rechten Zweig des Krebszyklus hin, der von Citrat zu Glutamat führt.

Computergestützte Multiplett-Analyse

Schnitte aus der 1H-13C-HSQC wurden auch quantitativ analysiert, indem 13C-NMR-Spektren für ein Gemisch verschiedener Isotopomere mit der Software pyGamma aus der NMRLab-Software simuliert wurden. Für Glutamat bestätigte die Multiplett-Analyse, dass die PDH-vermittelte Markierung sowohl nach 3 als auch nach 24 Stunden unabhängig von der BaP-Behandlung vorherrschend war. Für Aspartat bestätigte die Multiplett-Analyse, dass es eine Verschiebung von der PC-vermittelten Markierung nach 3 Stunden zur PDH-vermittelten Markierung nach 24 Stunden gab. Die simulierten Spektren sind in Additional file 5: Abbildung S4 dargestellt, und Tabelle 2 bestätigt die qualitativen Ergebnisse für Aspartat und Glutamat.