Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

Bakterienstämme sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt. Escherichia coli wurden auf Luria Broth (LB)-Platten oder in flüssigem LB-Medium, ergänzt mit 200 µg ml-1 Erythromycin, bei 37 °C kultiviert. Die Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA wurde mit chemisch kompetenten Zellen durchgeführt. S. pneumoniae Serotyp 2 D39 und Serotyp 4 TIGR4 und ihre isogenen Mutanten wurden auf Columbia-Blutagarplatten (Oxoid) mit Erythromycin (5 µg ml-1) und/oder Chloramphenicol (5 µg ml-1) kultiviert oder in Todd-Hewitt-Bouillon mit 0,5 % Hefeextrakt (THY; Roth) bzw. in chemisch definiertem Medium (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences) gezüchtet. Die Kultivierung der Pneumokokken auf Blutagar oder in Flüssigkulturen erfolgte bei 37 °C und 5 % CO2 ohne Umwälzung.

Mutantenkonstruktion

Für die Konstruktion der Pneumokokken-tacL-Mutanten in D39 und TIGR4 wurde ein DNA-Fragment bestehend aus der S. pneumoniae D39 spd_1672-Gen und seinen vor- und nachgeschalteten flankierenden Regionen besteht, durch PCR aus genomischer DNA unter Verwendung der Primer SPD1672_OLup_for und SPD1672_OLdwn_rev amplifiziert (die Primer sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt). Die gereinigten PCR-Produkte wurden in pUC18 kloniert und E. coli DH5α chemisch kompetente Zellen wurden mit dem resultierenden Plasmid transformiert. Das rekombinante Plasmid pNH1 mit dem gewünschten DNA-Insert wurde gereinigt und als Vorlage für eine inverse PCR-Reaktion mit den Primern InvrevKpnISPD1672 und InvforPstISPD1672 verwendet. Die deletierte Gensequenz wurde durch ein ermB-Gen ersetzt, das durch PCR aus dem Vektor pTP1 mit den Primern InvrevKpnIErm und InforPstIErm amplifiziert wurde. Das fertige rekombinante Plasmid wurde zur Transformation und Mutagenisierung von Pneumokokken verwendet. Die Transformationseffizienz wurde unter Verwendung des endgültigen rekombinanten Plasmids im Vergleich zu einem anderen Gendeletionsplasmid (zur Deletion des cbpL-Gens) in S. pneumoniae D39Δcps 44 bewertet. Bemerkenswerterweise war die Transformationseffizienz dabei für die tacL-Deletion deutlich erhöht (2,8 Kolonien pro ng Plasmid für cbpL vs. 29,8 Kolonien pro ng Plasmid für tacL).

Die isogenen Mutanten wurden durch ein pBAV1CpE-basiertes in trans-System ergänzt; pBAV1CpE wurde aus pBAV1K-T5-gfp45 modifiziert, indem das Kanamycin-Resistenzgen gegen ein Chloramphenicol-Resistenzgen und der T5-Promotor gegen eine Erythromycin-Promotorregion (pE) ausgetauscht wurde, die die ribosomale Bindungsstelle und das Startcodon enthält. Das vollständige spd_1672-Gen wurde durch PCR mit den Primern 1672_com_for und Spd1672_com_rev amplifiziert und das gereinigte Fragment in pBAV1CpE kloniert. Das resultierende Plasmid pBAV-tacL wurde zur Transformation isogener tacL-Mutanten verwendet. Die Deletion von tacL sowie die in trans-Komplementierung wurden mittels qRT-PCR verifiziert (ergänzende Abb. 3).

Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Der verkapselte und der nicht verkapselte D39-Wildtyp-Stamm, die tacL-defiziente Mutante und die komplementierte Mutante wurden in THY bis zur mittleren Log-Phase (A 600 = 0,35-0,45) kultiviert und für die RNA-Isolierung mit dem EURx GeneMatrix Universal RNA Purification Kit (roboklon) geerntet. Die Qualität der RNA wurde durch Agarosegel-Elektrophorese und Standard-PCR unter Verwendung der Primer EnoRT_F und EnoRT_R überprüft (siehe ergänzende Tabelle 2). Die Synthese von cDNA wurde mit SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) und hexameric_random Primern (GE Healthcare) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Qualität der cDNA wurde durch PCR unter Verwendung der Primer EnoRT_F und EnoRT_R kontrolliert, und die Konzentration wurde mit Nanodrop gemessen. cDNA wurde bis zu weiteren Tests bei -20 °C gelagert. Für die qRT-PCR-Experimente wurden das StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) und der SYBR® Green Master Mix (Biorad) in Kombination mit tacL-spezifischen Primern sowie Enolase-Primern als Kontrolle verwendet (siehe ergänzende Tabelle 2). Die StepOne-Software (v. 2.3, Life Technologies) wurde für die Datenanalyse verwendet. Die Endergebnisse werden als Fluoreszenzwert (ΔRn) aufgetragen gegen die PCR-Zykluszahl dargestellt.

Sequenzierung und bioinformatische Analyse

Sequenzierung: 1 ng gereinigte chromosomale DNA aus S. pneumoniae-Stämmen D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), und TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) wurden zur Herstellung einzelner Bibliotheken unter Verwendung des Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit verwendet. Ein Agilent Technology 2100 Bioanalyzer diente zur Überprüfung der Tagmentierung und der endgültigen Größenverteilung der Bibliotheksfragmente auf einem hochempfindlichen DNA-Chip. AMPure XP Beads wurden für die Aufreinigung der DNA-Bibliothek verwendet. Die endgültige gepoolte Bibliothek wurde auf ein MiSeq Reagent v3 600-Zyklus-Kit aufgetragen und auf einem MiSeq-System als 300-Zyklus-Paired-End-Lauf sequenziert. Der endgültige Bibliotheks-Pool wurde mit 5 % PhiX-Kontrollbibliothek aufgestockt. Es wurde eine Clusterdichte von 847 ± 25 (K mm-2) erreicht, wobei 96,46 ± 1,48 % der Cluster die Filterspezifikationen erfüllten. 20,3 Mio. Reads (94,7 %) von insgesamt 21,1 Mio. Reads bestanden die Filterspezifikationen, was zu 12,52 Gbp an Sequenzdaten führte. Die Index-Reads waren gleichmäßig auf die sechs einzelnen Proben verteilt. Die erzeugten FASTQ-Dateien wurden einer weiteren bioinformatischen Analyse unterzogen, wie im Folgenden beschrieben.

SNP-Erkennung und Annotation: Die SNP-Erkennung erfolgte für S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL einzeln mit „snippy“ (https://github.com/tseemann/snippy; Parameter: Mindestanteil für Variantennachweis: 60%; Mindestabdeckung der Variantenstelle: ≥5 Sequenzlesungen). Als Referenzgenom wurde Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) oder Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) verwendet.

Die resultierenden SNPs für jede Mutantengruppe (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) und (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) wurden zusammengeführt und verglichen. Die Genomabdeckung wurde mit qualimap46 geschätzt, wobei dieselben Referenzgenome wie bei der SNP-Erkennung verwendet wurden.

Isolierung von Pneumokokken-Teichosäuren

Extraktion und Isolierung von LTA: Die LTA-Reinigung wurde im Wesentlichen wie an anderer Stelle beschrieben7 durchgeführt, aber zur Optimierung der Ausbeute an pnLTA wurde ein bestimmtes Detail geändert. Pneumokokken-Zellen wurden in Citratpuffer (50 mM, pH 4,7) resuspendiert und dreimal mit einer französischen Presse (Constant Cell Disruption System, Seriennummer 1020) bei 10 °C und einem Druck von 20 kPSI aufgeschlossen. Den kombinierten Überständen wurde SDS in einer Endkonzentration von 4 % zugesetzt. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 100 °C inkubiert und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde bei 30.000×g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde viermal mit Citratpuffer unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen wie oben gewaschen. Die kombinierten LTA-haltigen Überstände und das resultierende Sediment, das den rohen PGN-WTA-Komplex enthielt, wurden getrennt gefriergetrocknet. Die resultierenden Feststoffe wurden beide fünfmal mit Ethanol gewaschen (Zentrifugation: 20 min, 20 °C, 10.650×g), um SDS zu entfernen, und lyophilisiert (was zu Pellet A mit LTA und Pellet B mit dem PGN-WTA-Komplex führte). Für die LTA-Isolierung wurde Pellet A in Citratpuffer resuspendiert und mit einem gleichen Volumen Butan-1-ol (Merck) bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugation bei 2.100×g für 15 min bei 4 °C getrennt. Die wässrige Phase (die LTA enthält) wurde aufgefangen, und das Extraktionsverfahren wurde zweimal mit der organischen Phase plus Zwischenphase wiederholt. Die kombinierten wässrigen Phasen wurden gefriergetrocknet und anschließend 5 Tage lang bei 4 °C gegen 50 mM Ammoniumacetatpuffer (pH 4,7; 3,5 kDa Cutoff-Membran) dialysiert; der Puffer wurde alle 24 Stunden gewechselt. Die resultierende rohe LTA wurde durch hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) auf einer HiPrep Octyl-Sepharose-Säule (GE Healthcare; 16 × 100 mm, Bettvolumen 20 ml) weiter gereinigt. Das LTA-Rohmaterial wurde in so wenig Ausgangspuffer (15% Propan-1-ol (Roth) in 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,7)) wie möglich gelöst und bei 13.000×g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde lyophilisiert. Das LTA-haltige Pellet wurde in dem HIC-Startpuffer in einer Konzentration von 30 mg ml-1 gelöst und durch HIC mit einem linearen Gradienten von 15 bis 60 % Propan-1-ol (Roth) in 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,7) gereinigt. Die LTA-haltigen Fraktionen wurden durch einen photometrischen Phosphattest identifiziert47. Die phosphathaltigen Fraktionen wurden kombiniert, gefriergetrocknet und nach dem Gefriertrocknen mit Wasser gewaschen, um Pufferreste zu entfernen.

Extraktion und Isolierung von WTA: Die Isolierung und Extraktion von WTA wurde wie an anderer Stelle beschrieben11 , jedoch mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Pellet B (das den rohen PGN-WTA-Komplex enthält), das bei der LTA-Isolierung anfiel, wurde in einer Konzentration von 10 mg ml-1 in 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) mit 20 mM MgSO4 resuspendiert. DNase A und RNase I wurden in Endkonzentrationen von 10 bzw. 50 µg ml-1 zugegeben. Die Suspension wurde 2 Stunden lang bei 37 °C gerührt. Anschließend wurden 10 mM CaCl2 und Trypsin (100 µg ml-1) zugegeben und das Rühren über Nacht bei 37 °C fortgesetzt. SDS in einer Endkonzentration von 1 % wurde zugegeben, und die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 80 °C inkubiert, um die Enzyme zu inaktivieren. Die Zellwand wurde durch 45-minütige Zentrifugation bei 130.000×g bei 25 °C gewonnen. Das resultierende Pellet wurde in 0,8 ml 8 M LiCl pro 1 ml der ursprünglich verwendeten Tris-HCl-Lösung resuspendiert und 15 min bei 37 °C inkubiert. Nach einer weiteren Zentrifugation unter denselben Bedingungen wie oben wurde das Pellet in 1 ml 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, pH 7,0) pro ml der ursprünglich verwendeten Tris-HCl-Lösung resuspendiert und diese Probe 15 min bei 37 °C inkubiert. Das Pellet wurde zweimal mit Wasser gewaschen. Schließlich wurde das Pellet in 2-4 ml Wasser resuspendiert und gefriergetrocknet, wodurch der gereinigte PGN-WTA-Komplex gewonnen wurde. Je nach Fragestellung wurden anschließend weitere chemische oder enzymatische Behandlungen durchgeführt.

Chemische und enzymatische Behandlungen

Hydrazin-Behandlung von LTA: Gereinigtes LTA wurde in einer Konzentration von 5 µg µl-1 in wasserfreiem Hydrazin (N2H4; ICN Biomedicals) gelöst und 1 h bei 37 °C unter Rühren inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des gleichen Volumens Aceton gequencht und unter einem Stickstoffstrom getrocknet; der Trocknungsschritt wurde zweimal wiederholt. Anschließend wurde das rohe de-O-acylierte LTA durch Gelpermeationschromatographie (GPC) auf einem Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; Säulengröße: 1,5 × 120 cm; Puffer: 150 mM Ammoniumacetat (pH 4,7))

Enzymatischer Verdau des PGN-WTA-Komplexes: Um alle Aminosäuren aus dem PGN zu entfernen, wurde der PGN-WTA-Komplex in 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) aufgelöst und mit der Pneumokokken-LytA-Amidase behandelt, wie an anderer Stelle beschrieben11. Rekombinante His-markierte LytA-Amidase (10 µg LytA pro mg) wurde in drei Aliquoten nach 0, 24 und 48 Stunden zugegeben, so dass die Inkubationszeit insgesamt 72 Stunden bei 37 °C betrug. Anschließend wurde das Enzym durch 5-minütiges Abkochen bei 100 °C inaktiviert. Nach Zentrifugation (25.000×g, 15 min, 20 °C) wurde der Überstand gesammelt und gefriergetrocknet. Der rohe, mit LytA behandelte PGN-WTA-Komplex wurde durch GPC auf einem Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; Säulengröße: 1,5 × 120 cm; Puffer: 150 mM Ammoniumacetat (pH 4,7)) gereinigt. Das erhaltene hochmolekulare Material (~12 mg) wurde mit Lysozym (200 µg; Sigma) und Mutanolysin (200 µg; Sigma) in einem 800 µl Reaktionsgemisch mit Natriumphosphat (20 mM; pH 4,8) und Natriumazid (0,02 %) bei 37 °C über Nacht weiter verdaut. Die Enzyme wurden durch Erhitzen auf 100 °C für 5 Minuten inaktiviert. Das lösliche Material wurde durch Zentrifugation (18.000×g, 10 min, 20 °C) gewonnen und lyophilisiert. Die Isolierung des an kleine PGN-Fragmente gebundenen pnWTA erfolgte durch eine abschließende GPC unter den oben genannten Bedingungen.

NMR-Spektroskopie

NMR-spektroskopische Messungen wurden in D2O bei 300 K mit einem Bruker AvanceIII 700 MHz (ausgestattet mit einer inversen 5-mm-Quadrupelresonanz-Z-Grad-Kryosonde) durchgeführt. Die deuterierten Lösungsmittel wurden von der Deutero GmbH (Kastellaun, Deutschland) bezogen. Aceton wurde als externer Standard zur Kalibrierung der 1H- (δH 2,225) und 13C- (δC 30,89) NMR-Spektren verwendet. Die 31P-NMR-Spektren (δP 0,0) wurden mit 85%iger Phosphorsäure in D2O als externem Standard kalibriert. Die 1H-NMR-Zuordnungen wurden durch zweidimensionale 1H-, 1H-COSY- und TOCSY-Experimente bestätigt, und die 13C-NMR-Zuordnungen wurden durch zweidimensionale 1H-, 13C-HSQC auf der Grundlage der 1H-NMR-Zuordnungen angegeben. Die interresiduale Konnektivität und weitere Hinweise auf die 13C-Zuordnung wurden durch zweidimensionale 1H-13C-HMBC- und 1H-13C-HSQC-TOCSY-Experimente ermittelt. Die Phosphatgruppen-Konnektivität wurde durch zweidimensionale 1H, 31P HMQC und 1H, 31P HMQC-TOCSY bestimmt. Alle Daten wurden mit Bruker TOPSIN V 3.0 oder höher erfasst und verarbeitet.

Massenspektrometrie

Um das an kleine PGN-Fragmente gebundene pnWTA zu analysieren, wurde die Elektrospray-Ionisations-Fourier-Transformations-Ionenzyklotron-Resonanz-Massenspektrometrie (ESI-FT-ICR-MS) auf einem 7-Tesla-APEX-Qe-Instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) unter Verwendung des Negativ-Ionen-Modus und einer Wasser/Propan-2-ol/7 M Triethylamin/Essigsäure-Mischung (50:50:0.06:0,02 v/v/v/v) als Lösungsmittel, wie zuvor beschrieben6. Die MS-Analyse der mit Hydrazin behandelten LTA wurde mit einem Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Deutschland) im Negativ-Ionen-Modus unter Verwendung desselben Lösungsmittels durchgeführt. Es wurde eine Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) Ionenquelle mit einer auf -1,1 kV eingestellten Sprühspannung verwendet. Die Massenskala wurde extern mit Glykolipiden bekannter Struktur kalibriert, und alle Spektren wurden ladungsdekonvolutiert. Die angegebenen Massenzahlen beziehen sich auf die monoisotopische Masse der neutralen Moleküle.

Elektronenmikroskopie

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie: Bakterien wurden im Wachstumsmedium mit 5% Formaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd für 1 h auf Eis fixiert und mit HEPES-Puffer (HEPES 0,1 M, 0,09 M Saccharose, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9) gewaschen. Ein Aliquot von 50 µl der fixierten bakteriellen Lösung wurde auf mit Poly-l-Lysin beschichtete Deckgläser gegeben und 10 Minuten lang absetzen gelassen. Nach der Fixierung mit 2 % Glutaraldehyd in PBS für 5 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Deckgläser mit TE-Puffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) gewaschen, bevor sie in einer abgestuften Reihe von Aceton (10, 30, 50, 70, 90 und 100 %) auf Eis für 10 Minuten pro Schritt dehydriert wurden. Die Proben wurden in der 100%igen Acetonstufe auf Raumtemperatur gebracht, bevor sie erneut in 100%iges Aceton getaucht wurden, bevor sie am kritischen Punkt mit flüssigem CO2 (CPD 30, Balzers, Liechtenstein) getrocknet wurden. Die getrockneten Proben wurden durch Sputterbeschichtung (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) mit einem Palladium-Gold-Film überzogen, bevor sie in einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop Zeiss Merlin (Oberkochen, Deutschland) unter Verwendung des HESE2 Everhart Thornley SE-Detektors und des SE-Detektors in der Linse in einem Verhältnis von 25:75 bei einer Beschleunigungsspannung von 5 kV untersucht wurden.

Transmissions-Elektronenmikroskopie: Die Bakterien wurden wie oben beschrieben fixiert und zusätzlich mit Osmiumtetroxid (1 % in HEPES-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen mit HEPES-Puffer wurden die Proben mit 10, 30 und 50 % Aceton auf Eis dehydriert, bevor sie über Nacht bei 7 °C in 70 % Aceton mit 2 % Uranylacetat inkubiert wurden. Die Proben wurden auf Eis mit 90- und 100-prozentigem Aceton dehydriert, auf Raumtemperatur gebracht, mit 100-prozentigem Aceton weiter dehydriert und dann in 100-prozentiges Ethanol getaucht. Anschließend wurden die Proben mit dem aromatischen Acrylharz LRWhite infiltriert. Nach einer 2-tägigen Polymerisation bei 50 °C wurden ultradünne Schnitte mit einem Diamantmesser geschnitten, auf mit Butvar beschichteten 3000er-Gittern gesammelt und 3 Minuten lang mit 4 % wässrigem Uranylacetat gegengefärbt. Die Proben wurden in einem Zeiss TEM 910 bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV und kalibrierten Vergrößerungen abgebildet.

Kontrast und Helligkeit wurden mit Adobe Photoshop CS3 eingestellt.

Generierung von Antikörpern

Polyklonale Antikörper gegen die analysierten CBPs wurden in Mäusen unter Verwendung von Routine-Immunisierungsprotokollen gezüchtet. Kurz gesagt, CD-1-Mäuse wurden intraperitoneal mit 20 µg rekombinantem Protein und Freund’s unvollständigem Adjuvans (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) (50:50 v/v) immunisiert. Am 14. und 28. Tag wurden die Mäuse mit 20 µg Protein und Freund’s unvollständigem Adjuvans (50:50 v/v) geboostet. Am 42. Tag wurden die Mäuse entblutet und polyklonales IgG wurde mit Protein A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) aus dem Serum gereinigt. Die Antikörper sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt.

Durchflusszytometrie

S. pneumoniae D39 Wildtyp, seine isogene tacL-Mutante und die komplementierte Mutante wurden in THY-Medium bis zur mittleren Log-Phase kultiviert, bei 3.275×g für 6 min geerntet und mit PBS (pH 7,4) gewaschen. Zur Quantifizierung des Kapselgehalts wurde eine 100-µl-Suspension, die 4 × 108 Bakterien enthielt, mit Anti-Kapsel-Polysaccharid-Antiseren (SSI Typ Serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 in PBS) für 30-45 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 in 96-Well-Platten (U-Boden, Greiner Bio-One) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Proben mit einem sekundären, mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG gekoppelten Alexa488-markierten Antikörper (Invitrogen) (1:500 in PBS, 30-45 min, 37 °C) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Bakterien über Nacht bei 4 °C mit 1%igem Formaldehyd fixiert.

Die Häufigkeit von CBPs sowie die Menge an Teichosäuren in nicht eingekapselten D39-Wildtyp-, Mutanten- und komplementierten Stämmen wurden nach der Fixierung mit 1%igem Formaldehyd für 1 h bei 4 °C durchflusszytometrisch gemessen. 200 µl Suspensionen mit 8 × 108 Bakterien wurden mit spezifischen polyklonalen Antikörpern gegen verschiedene CBPs (1:500 in PBS) oder zur Quantifizierung von TAs mit Antikörpern gegen P-Cho (TEPC-15) oder Forssman-Antigen (15 min bei 37 °C und 5% CO2) in 96-Well-Platten (U-Boden, Greiner Bio-One) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Proben mit einem sekundären Ziegen-Anti-IgG-gekoppelten Alexa488-markierten Antikörper (Invitrogen) inkubiert (15 min, 37 °C). Die Fluoreszenz wurde mit einem FACS Calibur™ (BD Biosciences) bestimmt.

Immunoblot-Analyse

S. pneumoniae D39, seine isogene tacL-Mutante und die komplementierte Mutante wurden in THY-Medium gezüchtet, bis ein A 600 von 0,35-0,45 erreicht war, durch Zentrifugation bei 3270×g bei 4 °C für 6 min geerntet und in 1 ml PBS-Puffer bei pH 7,4 resuspendiert. Insgesamt 2 × 108 Zellen pro Vertiefung wurden geladen und auf einer 12%igen SDS-PAGE getestet, bevor sie durch Semidry Blotting auf eine Nitrocellulosemembran übertragen wurden. Die Membranen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilch (Roth) und Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS; pH 7,4) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit polyklonalen Maus-Antikörpern gegen verschiedene CBPs (1:500 in 5 % Magermilch + TBS 0,01 % Tween (T-TBS)) inkubiert. Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Enolase (1:25.000 in 5 % Magermilch + T-TBS) wurde als Ladekontrolle verwendet. Die Membranen wurden mit T-TBS gewaschen, CBPs wurden mit dem sekundären fluoreszenzmarkierten IRDye® 800CW nachgewiesen. Ziegen-α-Maus-IgG und Enolase wurden mit dem fluoreszenzmarkierten IRDye® 680RD nachgewiesen. Ziege-α-Kaninchen-IgG-Antikörper wurden durch 45-minütige Inkubation mit dem entsprechenden Antikörper (1:15.000 in 5 % Magermilch in T-TBS) im Dunkeln bei Raumtemperatur nachgewiesen; die Membranen wurden mit T-TBS und anschließend einmal mit TBS gewaschen. Das Scannen der Membranen erfolgte mit einem Odyssey® CLx (LI-COR)-Scanner.

Triton X-100-induzierter Autolysetest

S. pneumoniae D39 Wildtyp, Mutante und komplementierter Stamm wurden in THY-Medium bis zur mittleren log-Phase kultiviert, bei 3275×g für 6 min geerntet und mit PBS (pH 7,4) gewaschen. Eine 1 ml Suspension mit 1 × 109 Bakterien wurde mit einer Endkonzentration von 0,01 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) inkubiert und bei 37 °C bebrütet. Die Lyse der Bakterienzellen wurde durch Messung der Absorption bei 600 nm zu vordefinierten Zeitpunkten überwacht.

Epithelialer Adhärenztest

Die Adhärenz von Pneumokokken an Epithelzellen wurde mit menschlichen A549-Zellen (ATCC® CCl-185TM) wie beschrieben analysiert48. Kurz gesagt wurden konfluente Epithelzellen, die auf Glasdeckgläsern (Hartenstein; in 24-Well-Platten, ~1 × 105 Zellen pro Well) gewachsen waren, mit 5 × 106 mittel-exponentiell gewachsenen Pneumokokken beimpft und in Infektionsmedium (DMEM (HyClone™) + 1% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)) bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 1 % FBS (Gibco) gewaschen, um ungebundene Bakterien zu entfernen. Anschließend wurden die Bakterien mit PBS mit 1 % Para-Formaldehyd (PFA, Roth) fixiert.

Immunfluoreszenzmikroskopie

Fixierte Pneumokokken, die an A549-Zellen gebunden waren, wurden dreimal mit PBS gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit PBS + 10 % FBS blockiert. Nach dem Waschen wurden die Proben 1 h bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen Antikörper (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) gegen Pneumokokken (hergestellt in Kaninchen gegen hitzeinaktivierte S. pneumoniae TIGR4 und D39) inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde ein fluoreszenzmarkierter Alexa-Fluor488-Anti-Kaninchen-Antikörper von der Ziege (Abcam) verwendet (1:500, 1 h, Raumtemperatur). Die bakterielle Adhärenz wurde für mindestens 20 Zellen pro Klasse Deckglas mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie überwacht. Jeder Versuch wurde dreimal in doppelter Ausführung wiederholt. Alle Daten sind als Mittelwerte ± s.d. angegeben. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten zweiseitigen Student’s t-Test durchgeführt. Bei allen Analysen wurde ein p-Wert von <0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Phagozytose-Experimente

Antibiotikaschutz-Assay: Eine konfluente Schicht monozytärer THP-1-Zellen (ATCC® TIB-202TM), die in 24-Well-Platten (3 × 105 Zellen pro Vertiefung in RPMI-1640 (HyClone™), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS, Gibco)) gezüchtet wurden, wurde durch Zugabe von 200 nmol ml-1 Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA, Sigma-Aldrich) zu Phagozyten differenziert und 48 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die THP-1-Zellen mit RPMI-1640, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, gewaschen und weitere 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Vor der Infektion wurden Pneumokokken in THY bis zur mittleren logarithmischen Phase (A 600 = 0,35-0,45) kultiviert, zentrifugiert und mit Infektionsmedium (RPMI-1640, ergänzt mit 1 % hitzeinaktiviertem FBS) gewaschen. Die THP-1-Zellen wurden gewaschen und mit Pneumokokken in 500 µl Infektionsmedium infiziert. Die Infektion wurde durch Zentrifugation (2 min, 300×g) synchronisiert, um einen gleichzeitigen Kontakt zwischen Bakterien und Phagozyten zu initiieren. Anschließend wurden die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für verschiedene Zeiträume inkubiert. Nach der Infektion wurden die Zellen mit Infektionsmedium gewaschen und mit Penicillin G (100 Einheiten ml-1, Sigma-Aldrich) und Gentamicin (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) für 1 Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Anschließend wurden die Phagozyten gewaschen und mit 1 % Saponin (Sigma-Aldrich) lysiert, um intrazelluläre Pneumokokken freizusetzen. Die koloniebildenden Einheiten (KBE) der intrazellulären Bakterien wurden durch Ausplattieren von Bakterien in entsprechender Verdünnung auf Blutagarplatten (Oxoid)49 bestimmt. Die zeitabhängige Abtötung intrazellulärer Pneumokokken wurde durch Abtötung extrazellulärer Pneumokokken mit Antibiotika wie oben beschrieben bewertet. Anschließend wurden die Phagozyten für verschiedene Zeiträume (0-3 h) in Infektionsmedium weiter inkubiert. Die intrazelluläre Bakterienzahl wurde wie oben beschrieben überwacht. Alle Experimente wurden viermal als Duplikate wiederholt. Die Daten wurden bei den Antibiotikaschutz-Assays auf die Infektionsmultiplikation (MOI) oder bei der zeitabhängigen Abtötung auf die wiedergefundenen Bakterien zum Zeitpunkt 0 h normalisiert. Alle Assays wurden mittels einseitiger ANOVA mit Bonferroni-Korrektur analysiert.

Doppelte Immunfluoreszenzfärbung und Mikroskopie

PMA-differenzierte THP-1-Zellen (3 × 105 Zellen pro Vertiefung) wurden auf sterilen Glasdeckgläsern (12 mm, Hartenstein) gezüchtet und wie oben beschrieben mit Pneumokokken infiziert. Nach der Infektion wurden die THP-1-Zellen mit dem Infektionsmedium gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd (Roth) über Nacht bei 4 °C fixiert. Die Glasdeckgläser wurden mit PBS gewaschen und 1 h lang mit PBS + 10 % hitzeinaktiviertem FBS blockiert. Nach dem Waschen wurden die extrazellulären Bakterien mit einem polyklonalen α-Pneumokokken-IgG (1:500) und einem Alexa-Fluor488-markierten sekundären Ziegen-α-Kaninchen-IgG (1:500, Abcam) 30 min lang bei Raumtemperatur gefärbt. Nach der Permeabilisierung der THP-1-Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBS (10 min, Raumtemperatur) wurden die Glasdeckgläser dreimal mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die intrazellulären Pneumokokken mit einem polyklonalen α-Pneumokokken-IgG (1:500) und einem sekundären Alexa-Fluor568-markierten Ziegen-α-Kaninchen-IgG (1:500, Abcam) für 30 Minuten bei Raumtemperatur angefärbt. Die Experimente wurden dreimal als Duplikate wiederholt. Für die statistische Analyse wurden 50 Zellen pro Glasdeckglas auf die Anzahl der intrazellulären Bakterien untersucht. Die Daten wurden auf den MOI normiert. Alle Assays wurden mittels einseitiger ANOVA mit Bonferroni-Korrektur analysiert. Bei allen Analysen wurde ein p-Wert von <0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Zelllinien

Alle in dieser Studie verwendeten Zelllinien wurden von ATCC erworben (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) und mittels PCR und Rasterelektronenmikroskopie auf Mykoplasmen-Negativität getestet.

Akute Mauspneumonie und systemisches Infektionsmodell

Acht bis zehn Wochen alte weibliche CD-1-Mäuse (outbred, Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden intranasal mit biolumineszenten Pneumokokken infiziert, wie kürzlich beschrieben50. Die Pneumokokken wurden bis zur mittleren exponentiellen Phase (A 600 = 0,35) in THY-Medium mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum kultiviert. Nach dem Zentrifugieren wurde die Infektionsdosis (20 µl) auf ~2,5 × 107 cfu in PBS (pH 7,4) eingestellt. Für die nasale Infektion wurden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Deutschland; Rompun, Provet AG, Lyssach, Deutschland) betäubt, und die Bakterien wurden tropfenweise in die Nasenlöcher verabreicht. Die KBE der Infektionsdosis wurde durch Ausplattieren von seriellen Verdünnungen des Inokulums auf Blutagarplatten bestätigt. Das Überleben der Mäuse wurde überwacht und die Biolumineszenz in vorher festgelegten Abständen mit dem IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA) gemessen. Für das systemische Infektionsmodell wurde eine Infektionsdosis von 3 × 103 cfu intraperitoneal in einem Volumen von 200 µl PBS (pH 7,4) verabreicht. Alle Tierversuche wurden gemäß den deutschen Vorschriften der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS) und dem europäischen Gesundheitsgesetz der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) durchgeführt. Alle Versuche wurden vom Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Deutschland, Genehmigungsnummer 7221.3-1-056/16-1) genehmigt.

Datenverfügbarkeit

Roh-FASTQ-Dateien mit genomischen Sequenzdaten von S. pneumoniae wurden an das EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) übermittelt und im Short Read Archive (SRA) unter der Studienzugangsnummer RJEB18558 gespeichert. Alle anderen relevanten Daten, die die Ergebnisse der Studie untermauern, sind in diesem Artikel und den ergänzenden Informationsdateien enthalten oder auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.