2.2 Produktionsstrategien für Levan

Levan wird als Exopolysaccharid (EPS) in der extrazellulären Matrix von Bakterien verschiedener Gattungen synthetisiert, wie Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus und Zymomonas (Sarilmiser et al., 2015). Zusätzlich zu diesen extremophilen Levanproduzenten berichteten Poli et al. (2009) über Halomonas sp. als Levanproduzenten. Weitere Studien untersuchten die potenzielle Verwendung von Halomonas levan als Bioflockungsmittel (Sam et al., 2011), peptid- und proteinbasiertes Drug-Delivery-System (Sezer et al., 2011, 2015), biokompatibles Dünnmittel (Sima et al., 2011, 2014), klebende Mehrschichtfolie (Costa et al., 2013) und ein Heparin-nachahmendes Glykan (Erginer et al., 2016). Abb. 12.2 zeigt den allgemeinen Produktionsprozess für mikrobielles Levan.

Abbildung 12.2. Grundlegende nachgeschaltete Verarbeitungsschritte für Levan.

Mikrobielle EPS werden normalerweise in aeroben, submersen Fermentationssystemen hergestellt. Die Fermentationsbedingungen, wie Belüftung, Rühren, pH-Wert, Konzentration an gelöstem Sauerstoff, Temperatur, Zusammensetzung des Mediums und Design des Bioreaktors können die Eigenschaften des Produkts und die Produktionsausbeute bestimmen. Um eine hohe Produktionsqualität und -ausbeute zu erreichen, müssen diese Parameter daher für jeden Organismus sorgfältig optimiert werden (Öner et al., 2016). Srikanth et al. (2015) untersuchten beispielsweise die Auswirkungen von Fermentationsparametern wie dem anfänglichen pH-Wert, der Levansupplementierung, der Saccharosekonzentration, der Stickstoffquelle, der Inokulumkonzentration und der Kultivierungszeit auf die Levansynthese unter Verwendung von Acetobacter xylinum NCIM2526 als Produzentenstamm. Als optimale Bedingungen wurden 10, 50-60 und 1,49 g/L für Stickstoff, Saccharose bzw. Inokulum ermittelt. Nach den ersten 24 Stunden stieg der Levandertrag deutlich an, und die maximale Levanderzeugung wurde nach 122 Stunden erreicht, wenn der anfängliche pH-Wert auf 6,8 eingestellt war. Eine Erhöhung der anfänglichen Levanzugabe von 0,1 auf 0,4 g/L steigerte die Ausbeute von 1,22 auf 1,65 g/L; alles, was über 0,4 g/L hinausging, führte zu keiner weiteren Steigerung der Ausbeute. Inokulumkonzentrationen zwischen 5 % (v/v) und 10 % (v/v) führten erwartungsgemäß zu einer Veränderung der Ausbeute an Lebendgestein, und die maximale Ausbeute (1,46 g/L) wurde bei 7 % (v/v) erreicht. Saccharosekonzentrationen von 20 bis 80 g/L wirkten sich auf die Ausbeute des Levans aus. Im Bereich von 40-50 g/L stieg die Produktionsausbeute, im Bereich von 70-80 g/L sank sie, und im Bereich von 20-40 g/L blieb sie unverändert.

Sarilmiser et al. (2015) untersuchten die Levanproduktion in einem halophilen Mikroorganismus (Halomonas smyrnensis AAD6T) unter Verwendung verschiedener stimulierender Faktoren. So wurden beispielsweise verschiedene Fütterungsstrategien in unterschiedlichen Zeitintervallen in einem Batch-Bioreaktorsystem angewendet und mehrere Ausgangsbedingungen in Schüttelkulturen getestet. Unter den verschiedenen getesteten pH-Werten und Saccharosekonzentrationen wurde der maximale Levandertrag bei pH 7 (1,345 g/L Levander) und 50 g/L Saccharose (1,320 g/L Levander) erreicht. Wenn Stickstoff- und Phosphorbeschränkungen angewendet wurden, sanken sowohl die Levankonzentration als auch die Biomasse, während die Yp/x-Werte stiegen. Stickstoffimpuls-Strategien verringerten die Levansynthese aufgrund der verlängerten Wachstumsperiode, Saccharose-Impuls-Strategien verbesserten das Zellwachstum und die Levansynthese erheblich, und NaCl-Impulse hatten keine Auswirkungen auf das Wachstum. Interessanterweise produzierten Kulturen, die in Gegenwart von Borsäure gezüchtet wurden, unter kontrollierten Bioreaktor-Bedingungen die höchsten Konzentrationen von Levane (8,84 g/L). Diese Verbesserung wurde durch das biologische Phänomen erklärt, das als Quorum Sensing (QS) bekannt ist und an dem Boratome beteiligt sind; eines der Signalmoleküle, die an QS in H. smyrnensis AAD6T beteiligt sind, wurde später als C16-Acylhomoserinelacton identifiziert (Abbamondi et al., 2016).

Das Molekulargewicht des Levans ist ein entscheidender Faktor für seine Anwendbarkeit in verschiedenen Branchen, einschließlich der Lebensmittel-, Kosmetik- und Medizinindustrie (Belghith et al., 1996). Die Bestimmung der optimalen Bedingungen für die Herstellung von Levane ist entscheidend, um die gewünschte Molekulargewichtsverbindung zu erhalten (Porras-Domínguez et al., 2015). Wu et al. (2013) bewerteten beispielsweise subtile Änderungen im Produktionsprozess, um verschiedene Molekulargewichte von Levane in Batch- und Fed-Batch-Systemen zu erhalten, wobei Bacillus subtilis (natto) Takahashi als Produktionsstamm verwendet wurde. Bei hohen (400 g/L) und niedrigen (20 g/L) Konzentrationen von Saccharose wurde ein niedrigeres bzw. höheres Molekulargewicht des Levans erzielt. Diese lineare Beziehung wurde auf die Wirkung von Saccharose auf das Enzym Levansucrase zurückgeführt. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass das Molekulargewicht von Levansucrase von den Reaktionsbedingungen wie pH-Wert, Temperatur, Rührgeschwindigkeit und Saccharose abhängt, wobei letztere der wirksamste Faktor ist, der das Molekulargewicht von Levansucrase bestimmt.

Die Produktion von Levansucrase in immobilisierten Zellsystemen ist ebenfalls vorteilhaft, da solche Systeme von relativ einfachen nachgeschalteten Prozessen, einer hohen volumetrischen Produktivität, einer fortschrittlichen Prozesskontrolle und einem geringeren Kontaminationsrisiko bei der EPS-Produktion profitieren (Ürküt et al., 2007). Die Umsetzung dieser vorteilhaften Methode für die Levan-Produktion kann als Alternative zu Batch-, Fed-Batch- und kontinuierlichen Verfahren eingesetzt werden (Öner et al., 2016). Silbir et al. (2014) beispielsweise untersuchten die Levan-Produktion in Batch- und kontinuierlichen Fermentationssystemen mit Zymomonas mobilis B-14023. Die kontinuierliche Fermentationsproduktion wurde in einem Festbett-Bioreaktor unter Verwendung von immobilisierten Ca-Alginat-Zellen durchgeführt. Die Inkubationszeit, der anfängliche pH-Wert und die Substratkonzentration waren die drei wichtigsten Prozessvariablen für die Batch-Produktion von Levan. Die höchste Menge an Evan (40,2 g/L) wurde produziert, wenn Hefeextrakt als organische Stickstoffquelle in Schüttelkolbenkulturen verwendet wurde. Darüber hinaus wurden immobilisierte Z. mobilis-Zellen im kontinuierlichen Fermentationssystem erfolgreich für die Produktion von Levane eingesetzt. Unkontrollierbarer Druckabfall im System und der Bruch von Ca-Alginat-Gelkügelchen waren die größten Einschränkungen für längere Fermentationszeiten.

Trotz der Vielfalt an levanproduzierenden Mikroorganismen bleiben die Produktionskosten für das Polysaccharid levan hoch. Dies ist wahrscheinlich der größte Engpass bei seiner Kommerzialisierung (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Die Fermentationsmedien machen etwa 50 % der Produktionskosten für einen mikrobiellen Prozess aus (Van Hoek et al., 2003); bisher wurden jedoch kostengünstige Kohlenstoffquellen wie Sirupe und Melasse für die mikrobielle Levante-Produktion verwendet (Özcan und Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) untersuchten Zuckerrübenmelasse und Stärkemelasse als Saccharose-Ersatz in Halomonas-Kulturen. Klärung, pH-Wert, Schwefelsäure, Tricalciumphosphat und Aktivkohle-Vorbehandlungen wurden in verschiedenen Kombinationen verwendet, um die chemische Verfügbarkeit für die Lewanproduktion einzustellen. Es wurde festgestellt, dass bei einer TCPHAC-Konzentration von 10 g/L eine maximale Ausbeute von 4,19 bzw. 3,68 g/L erreicht wurde. Bei der Verwendung von 30 g/L TCPHAC und HAC wurde eine Ausbeute von 7,56 und 4,44 g/L erreicht. Die Entfernung von Schwermetallen und die Erhöhung der Eisenkonzentration führten in dieser Studie zu einem Rückgang der Zellintegrität und der Ausbeute an Levan. In anderen Studien wurden Zuckerrohrmelasse in Bacillus lentus V8 Kulturen (Abou-Taleb et al., 2015), Dattelsirup in Mycobacterium levaniformis 1406 Kulturen (Moosavi-Nasab et al., 2010), Zuckerrübenmelasse in Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 Kulturen (Han und Watson, 1992) und Zuckerrohrmelasse und -sirup in Z. mobilis ATCC 31821 Kulturen (De Oliveira et al., 2007) wurden als kostengünstige Kohlenstoffquellen für die Levansucrase-Produktion untersucht.

Die Biosynthese von Levansucrase in submersen Fermentationssystemen ist durch das Erfordernis eines zellulären Wachstums begrenzt, das möglicherweise nicht die optimalen Bedingungen für eine hohe Levansucrase-Aktivität bietet (Santos-Moriano et al., 2015). Zellfreie Systeme heben diese Einschränkung jedoch auf und bieten zusätzliche Vorteile, wie z. B. eine einfache Vorbereitung, Wiederverwendbarkeit und Kontrolle von Veränderungen der Mikroumgebung (Jang et al., 2001). Aus diesem Grund ist es von entscheidender Bedeutung, eine optimale Umgebung für Levansucrase zu schaffen. Lu et al. (2014) untersuchten beispielsweise den Einfluss verschiedener Faktoren wie Substratkonzentration, Reaktionszeit, Temperatur und pH-Wert auf die Levan-Produktion mit rekombinanter Levansucrase in einem zellfreien System. Sie beobachteten eine maximale Ausbeute an Levansucrase (7,1 g/L) bei 0,8 M Saccharose, einem pH-Wert von 6,5 und 40 °C für 24 Stunden. Die Ausbeute an Levansucrase stieg parallel zu einem Anstieg der Saccharosekonzentration von 0 auf 0,8 M. Ihre Studie zeigte, dass das rekombinante Enzym ähnliche biochemische Eigenschaften wie das native Enzym aufweist.