Biologische Tests von Bradykinin und verwandten Kininen
Kinine sind bei allen untersuchten Tierarten potente blutdrucksenkende Mittel (54). Der gängigste In-vivo-Test für diese Peptide ist der bereits beschriebene Blutdrucktest bei Ratten. Die gefäßerweiternde Wirkung der Kinine wird an isolierten, durchbluteten Organen mit intaktem Endothel nach dem in Abschnitt IV beschriebenen Verfahren gemessen. Die entspannende Wirkung der Kinine in arteriellen Gefäßen wird in vitro an der Halsschlagader des Hundes (57) nach der von Regoli und Barabé (34) beschriebenen Methode untersucht. Die venokonstriktorische Wirkung wird in vitro in der Kaninchen-Jugularvene (42) nach dem unten zusammengefassten Verfahren gemessen.
Die Venen, die Kaninchen (1,0-2,0 kg) entnommen wurden, werden in schraubenförmige Streifen von 2 mm Breite und 2 cm Länge geschnitten und in Krebslösung (mit Sauerstoff angereichert bei 37°C) aufgehängt, die einen konvertierenden Enzyminhibitor (Captopril, 10 μM) enthält, um den Abbau von Kinin zu verhindern (34). Die Kontraktionen des Gewebes als Reaktion auf Kinine werden wie zuvor beschrieben aufgezeichnet, und in der Regel werden vollständige Konzentrations-Wirkungs-Kurven gemessen, um die Affinitäten der Kinine und ihrer Antagonisten zu bewerten. Die Jugularvene des Kaninchens enthält nachweislich einen B2-Rezeptor-Subtyp (B2A) (Tabelle V).
Das am häufigsten verwendete nichtvaskuläre Präparat ist das Ileum des Meerschweinchens, das 250-350 g schweren Meerschweinchen entnommen und nach Rang (37) in Form eines länglichen glatten Muskelstreifens präpariert wird. Das Gewebe wird in vitro in Krebslösung (mit Sauerstoff angereichert bei 37°C) suspendiert und seine Spannungsänderungen werden wie oben für die isolierten Gefäße beschrieben gemessen (siehe Abschnitt I). Das Meerschweinchen-Ileum ist das Präparat, das zur Charakterisierung des B2B-Rezeptor-Subtyps verwendet wird (Tabelle V).
B1-Rezeptoren werden unter Verwendung des Kaninchen-Aorta-Streifens untersucht, der auf die gleiche Weise wie für Angiotensin präpariert und behandelt wird. Das Gewebe ist zu Beginn des Versuchs nahezu unempfindlich gegenüber Kininen, insbesondere gegenüber desArg9BK, dem Bt-Rezeptor-Agonisten. Die Empfindlichkeit des Gewebes nimmt über mehrere Stunden (bis zu 6-10 Stunden) der Inkubation zu, da B1-Rezeptoren neu gebildet werden (55). Die kontraktilen Wirkungen der Kinine werden mit denselben Instrumenten und Methoden aufgezeichnet und analysiert, die in Abschnitt I für Angiotensin beschrieben sind. Kaninchengewebe kann für desArg9BK sensibilisiert werden, indem die Tiere mit Lipopolysaccharid (LPS) vorbehandelt werden, das 5 Stunden vor der Tötung des Tieres intravenös injiziert wird (56). Der Mechanismus der B1-Rezeptorgenerierung durch LPS wurde untersucht (60, 61). Aorten und andere Gewebe von LPS-behandelten Kaninchen reagieren von Beginn der Inkubation in vitro auf desArg9BK (56). Ebenso exprimieren Nierenarterien von Hunden spontan B1-Rezeptoren und zeigen eine hohe Empfindlichkeit gegenüber desArg9BK (62).
Mit Hilfe der biologischen Reaktionen (kontraktil) von drei Präparaten (Tabelle V) wurden verschiedene Verbindungen zur Charakterisierung von Kinin-Rezeptoren in isolierten Organen verwendet. Bradykinine und Kallidin stimulieren die Jugularvene des Kaninchens (RJV) und das Ileum des Meerschweinchens (GPI) stark, während desArg9BK und Lys,desArg9BK inaktiv sind. In der Kaninchenaorta (RA) wird die umgekehrte Reihenfolge der Potenz beobachtet. desArg9BK ist nur in der RA ein Antagonist. Auf dieser Grundlage schlugen Regoli und Barabé (54) die Hypothese zweier Kininrezeptoren vor, des B1- (RA) und des B2-Rezeptors (RJV, GPI und viele andere Präparate und Tests), der zunächst nur mit Agonisten charakterisiert wurde (54) und später (siehe unten) mit Antagonisten charakterisiert worden ist. B2-Rezeptorantagonisten wurden von Vavrek und Stewart (63) identifiziert und in der Folge von verschiedenen Forschern (64-66) durch den Ersatz von Pro3 durch Hydroxyprolin (Hyp), durch die Hinzufügung eines d-Arg am N-Terminus, durch den Ersatz von Phe8 durch Leu und durch den Ersatz des Dipeptids Pro7-Phe8 durch d-Tic-Oic (67-69) verbessert. Ein Prototyp jeder Antagonistenreihe ist in Tabelle V aufgeführt, um zu zeigen, dass b-2-Thienyl-Elanin (Thi) in den Positionen 5 und 9 nicht benötigt wird, während Hyp3 und d-Arg0 für die Affinität wichtig sind, insbesondere am RJV. Die Substitution von Phe8 durch Leu führt zusammen mit den anderen Modifikationen zu d-ArgBK, das (a) fast keine agonistische Aktivität aufweist und (b) aktiv auf dem RJV, weniger aktiv auf dem GPI und eher schlecht auf dem RA (B1) ist und daher ziemlich selektiv für die B2-Stelle ist. Der Unterschied zwischen den pA2-Werten (um zwei logarithmische Einheiten) zwischen dem RJV und dem GPI ist ein entscheidendes Ergebnis für die vorgeschlagene (Tabelle V) Unterteilung der B2-Rezeptoren in B2A (RJV) und B2B (GPI). D-ArgBK ist ein kompetitiver Antagonist, der sowohl in vivo als auch in vitro schnell reversibel ist und sich von Hoe 140 unterscheidet, das nicht-kompetitiv ist (kein Gleichgewicht), wahrscheinlich weil es eine verlängerte Interaktion sowohl mit der B2A- als auch der B2B-Stelle hat (59, 67, 68, 70). Die Unterscheidung zwischen B2A und B2B wird durch die Ergebnisse unterstützt, die mit den beiden letzten Verbindungen (Tabelle V) erzielt wurden, die sich durch den Rest in der dritten Position unterscheiden. Das Vorhandensein von Hyp begünstigt den Antagonismus (pA2 7,6) auf dem B2A und eine teilweise agonistische Aktivität auf dem B2B, während Tyr3 einen starken Agonisten auf dem B2A und einen ziemlich guten Antagonisten (reiner Antagonist) auf dem B2B ergibt. Diese neue Klassifizierung wurde in einem Übersichtsartikel vorgestellt (71). Die Kinin-Funktionsstellen sind also B und B2 (zwei Subtypen werden in Betracht gezogen). Mehrere andere Rezeptoren (B3, B4 und B5) wurden vorgeschlagen (72-74), ihre Existenz wurde jedoch nicht durch solide experimentelle Daten nachgewiesen (siehe kritische Übersicht in Ref. 59). Die Kinin-induzierte Histaminfreisetzung aus peritonealen Mastzellen der Ratte ist ein unspezifisches Phänomen, das auf den kationischen Charakter der Kinine zurückgeführt wird (75, 76).