Karles V. musste ein anderes Porträt finden, nämlich das von Österreich, das Isabella von Portugal Margret vor ihrem Tod geschickt hatte. Seine Schwester schickte das Porträt im November und Karl war sehr enttäuscht, dass es nicht wie eines für seine Frau aussah. Da er mit dem Porträt unzufrieden war, musste er Tizian bitten, ein Kunstwerk zu finden, das seiner Frau ähnelte.
Titian malte das Isabella-Porträt im Jahr 1545, Tizian richtete es ein und Karls Frau trug ein schwarzes Kleid und in ihrem Schoß hatte sie Blumen, hinter sich hatte sie eine prächtige Krone. Im EI Pardo Palast wurde diese Kunst durch ein Feuer zerstört, diese Geschichte ist in Drucken und mehreren Kopien überliefert. Das Porträt hatte die Nase verloren, so dass Karl es nach Augsburg brachte, damit der Künstler daran arbeiten konnte, die Nase neu zu malen. Im September des Jahres 1548 benutzte der Künstler das alte Modell, um das aktuelle anzufertigen, und auch dieses wurde in Augsburg gemalt. Karl und Isabella hatten ein gemeinsames Porträt und ein Duplikat in der Sammlung der Fundacion Casa de Alba in Madrid, das die beste und erste Kombination von Isabella von Portugal und Karl V. darstellte.
Die Kunst von Tizian weckte Erinnerungen an Isabella von Portugal und das Bildnis, das beide zeigte, erinnerte Karl an seine Frau. Karl verlangte die Kunst und wollte keine exakten Gemälde, sondern die, die er im Kopf hatte, visualisieren. Karl wollte, dass Tizian das Porträt der verlorenen Nase malte, weil er es so malen konnte, wie die Nase aussah. Die Porträts, die zu ihren Lebzeiten angefertigt wurden, sahen echt aus und zeigten, dass Isabella von Portugal eine aquiline Nase hatte – ein einzigartiges Merkmal, das vielen auffiel. Tizian musste dieselbe Korrektur von einer klassischen geraden Nase zu einer gebogenen vornehmen, die Isabella von Portugal hatte. Die kleinen Dinge in den Porträts, die Erinnerungen an Isabella weckten, veranlassten Karl dazu, die Kunst nahe zu halten, und all dies ist in Dokumenten wie Yuste und Brüssel festgehalten, wobei letzteres 1556 und ersteres 1558 dokumentiert wurde.
Die Porträts, die Tizian anfertigte, waren denen von Giulio Romano sehr ähnlich. Das von Eleonora Gonzaga, einer Herzogin aus Urbino, ist das, was Tizian sah und die Fähigkeiten in den Gemälden nutzte, um Isabella-Porträts zu machen. Die Bilder von Isabella von Portugal waren eine gewisse Herausforderung, da es sich nicht um eine Realität handelte, sondern nur um eine, die Erinnerungen wecken sollte. Isabella von Portugal Porträts waren große Arbeit von Tizian getan, aber wenn man genau hinschaut, zeigte es, dass die Leinwand verwendet wurde zuvor eine Kunst von einer Frau. Die Leinwand, auf der Isabella von Portugal gemalt war, wurde Maria, der Schwester von Philipp dem Zweiten, geschenkt. Es war für ein Kloster namens Descalzas Reales bestimmt. Im Jahr 1636 wurde es nach Madrid in den Alcazar gebracht und blieb dort bis zu einem Brand im Jahr 1734.