Genom-Sequenzierung und Assemblierung

Wir sequenzierten das Genom der heiligen Lotus-Sorte ‚China Antique‘ mit 94,2 Gb (101×) Illumina und 4,8 Gb (5,2×) 454-Sequenzen. Die endgültige Assemblierung umfasst 804 Mb, 86,5 % des geschätzten 929 Mb großen Lotosgenoms. Die Contig N50 beträgt 38,8 kbp und die Scaffold N50 3,4 Mbp (Tabelle S1 in Zusatzdatei 1). Die größten 429 Scaffolds machen 94,8 % des assemblierten Genoms und 98,0 % der annotierten Gene aus. Unter den 39 bisher veröffentlichten Pflanzengenomen liegt der Median der N50-Gerüstlänge bei etwa 1,3 Mb, was Lotus zum achtbesten assemblierten Genom macht (Tabelle S2 in Zusatzdatei 1). Wir erstellten eine hochdichte genetische Karte mit 3.895 sequenzbasierten, restriktionsassoziierten DNA-Sequenzierungsmarkern und 156 einfachen Sequenzwiederholungsmarkern. Erstere wurden in 562 ko-segregierende Bins sortiert und insgesamt 698 informative Marker wurden in neun Verknüpfungsgruppen für die acht Lotus-Chromosomen kartiert, wobei eine Lücke zwischen zwei Verknüpfungsgruppen verbleibt (Tabelle S3 in Zusatzdatei 1). Die neun verankerten Megastrukturen haben eine Gesamtgröße von 543,4 Mb, was 67,6 % des Genomaufbaus ausmacht, und sie sind größtenteils proportional zum Karyotyp der Lotus-Chromosomen (Abbildung S2 und S3 in Zusatzdatei 1). Die hohe Qualität der Lotosgenomassemblierung ist weitgehend auf die unerwartete Homozygotie der Sorte „China Antique“ zurückzuführen. Obwohl es sich bei Lotus um eine Auskreuzungspflanze handelt, könnte der Anbau und die vegetative Vermehrung über Rhizome in den letzten 7.000 Jahren zu einem engen genetischen Engpass geführt haben. Dies könnte zum Teil die Folge ihrer einzigartigen Eigenschaft, der Langlebigkeit der Samen, sein, die die Anzahl der Generationen in ihrer Evolutionsgeschichte zusätzlich zur vegetativen Vermehrung weiter reduziert haben könnte. Die geschätzte Heterozygotie von ‚China Antique‘ ist mit 0,03 % niedriger als die 0,06 % der sequenzierten Papaya-Sorte ‚SunUp‘ nach 25 Generationen Inzucht. Die geschätzte Heterozygotie in der amerikanischen Lotus-Sorte N. lutea ‚AL1‘ ist mit 0,37% ebenfalls niedrig.

Wiederholungsgehalt des heiligen Lotus-Genoms

Repetitive Sequenzen machen 57% des assemblierten Genoms aus, darunter 47,7% erkennbare transponierbare Elemente (Tabelle S4 in Additional file 1). Im Gegensatz zu den meisten Pflanzen, die relativ unbedeutende nicht-lange terminale Repeat-Retrotransposons aufweisen (etwa 1 % des Genoms), tragen solche nicht-langen terminalen Repeat-Retrotransposons 6,4 % zum Lotosgenom bei. Im Gegensatz zu anderen Pflanzen, die in der Regel mehr Gypsy-ähnliche Elemente aufweisen, sind Copia- und Gypsy-ähnliche Elemente in der Kopienzahl und im Genomanteil von Lotus vergleichbar. Die meisten wichtigen DNA-Transposon-Familien werden im heiligen Lotus nachgewiesen (sie machen 16 % des Lotosgenoms aus), wenn auch mit mehr als 10-facher Variation in der relativen Häufigkeit. Eine Ausnahme, die Tc1/Mariner-Superfamilie, fehlt sowohl im Lotos- als auch im Traubengenom, was auf den häufigen Verlust dieser Elementfamilie hindeutet. Überraschenderweise machen hAT-Elemente (Ac/Ds-like) fast 7 % des Lotosgenoms aus und sind mit mehr als 100 000 Kopien vertreten, mehr als in jedem anderen sequenzierten Pflanzengenom. Davon sind CACTA-Elemente am wenigsten häufig (0,4 %), während MULE-, PIF- und Helitron-Elemente in mäßigem Umfang amplifiziert sind (2,5 %, 2,7 % bzw. 3,6 %). Das Lotus-Genom enthält außerdem 1.447 Pack-mutatorähnliche Elemente, die Gene oder Genfragmente tragen. Die Analyse mit Hilfe von expressed sequence tags (ESTs) zeigte, dass mindestens 10 Pack-mutator-ähnliche Elemente exprimiert werden, was darauf hindeutet, dass sie eine funktionelle Rolle spielen könnten.

Genom-Annotation und Genexpression

Nach dem Repeat-Masking und der Annotation haben wir 26.685 proteinkodierende Gene in Lotus abgeleitet, darunter alle 458 eukaryotischen Kernproteine; 82 % der Gene haben Ähnlichkeit mit Proteinen in SwissProt, wie durch das Basic Local Alignment Search Tool identifiziert (E <0,0001). Die durchschnittliche Genlänge beträgt 6.561 bp mit medianen Exon- und Intronlängen von 153 bp bzw. 283 bp (Tabelle S1 in Additional file 1). Die durchschnittliche Gendichte beträgt ein Gen pro 30 kb, wobei die Gene gleichmäßiger über das assemblierte Genom verteilt sind als in vielen anderen Pflanzengenomen (Abbildung S2 in Zusatzdatei 1), die durch genreiche Regionen gekennzeichnet sind, die häufig in den distalen Regionen der Chromosomenarme zu finden sind. Insgesamt 12.344 ESTs wurden an 11.741 Genmodellen ausgerichtet, und 174 alternative Spleißereignisse wurden aus 164 Genen mit 380 EST-Contigs identifiziert (Tabelle S5 in Zusatzdatei 1). Von den annotierten Genen in Lotus zeigen 22.803 (85,5 %) eine Expression in Rhizomen, Wurzeln, Blättern oder Blattstielen, basierend auf RNAseq-Daten (Abbildung S4 in Zusatzdatei 1). Die Expression der übrigen Gene ist wahrscheinlich auf Samen, Blüten und andere nicht untersuchte Gewebe beschränkt. Die Expression von 3.094 proteinkodierenden Genen war gewebespezifisch, darunter 1.910 Gene, die nur in Rhizomen und 841 nur in Wurzeln exprimiert wurden; 14.477 Gene werden in allen untersuchten Geweben exprimiert. Unter den 1 910 rhizomspezifischen Genen fanden wir mehrere AP2-ähnliche, auf Ethylen reagierende Transkriptionsfaktoren, BTB/POZ-Domäne-enthaltende Proteine, Hitzeschockproteine, Homeobox-Transkriptionsfaktoren, Kinesine und Pentatricopeptid-Repeat-enthaltende Proteine (PPRs) (Tabelle S6 in Zusatzdatei 1). Bei Lotus wurden 544 Gene als PPRs annotiert, von denen 201 in den vier untersuchten Geweben und 199 nur im Rhizom exprimiert wurden. PPRs wurden als eine Gruppe von RNA-bindenden Proteinen identifiziert, die an der RNA-Verarbeitung, -Stabilität, -Editierung, -Reifung und -Translation in Pflanzen beteiligt sind. Obwohl der molekulare Mechanismus ihrer Funktion noch nicht geklärt ist, ist ihr breiter Ausdruck im Rhizom von Lotus bemerkenswert.

Ortholog-Klassifizierung und Gehalt an Vorfahren in Eudikotyledonen

Die proteincodierenden Gensätze von Lotus und 16 anderen sequenzierten Angiospermenarten wurden verwendet, um mit Proteinortho v4.20 mutmaßliche orthologe Gencluster zu identifizieren. Insgesamt wurden 529.816 nicht-redundante Gene in 39.649 orthologe Gencluster (Orthogruppen) klassifiziert, die mindestens zwei Gene enthalten (Tabelle S7 in Zusatzdatei 1). Von den 26.685 proteinkodierenden Genen in Lotus wurden 21.427 (80,3 %) in 10.360 Orthogruppen klassifiziert, von denen 317 nur Lotusgene enthielten.

Aus dieser Genklassifizierung schätzen wir einen minimalen Gensatz von 7.165 Genen in 4.585 Orthogruppen für Eudicots (Tabelle S7 in Zusatzdatei 1). Der minimale Gensatz für die Kern-Eudicots (7.559 Gene in 4.798 Orthogruppen) ist nur geringfügig größer als der eudicot-weite Satz, was darauf hindeutet, dass der minimale Gensatz des Eudicot-Monocot-Vorfahren (6.423 Gene in 4.095 Orthogruppen) mindestens 490 Orthogruppen hinzufügen würde, die mit den Eudicots als Ganzes verbunden sind.

Wir rekonstruierten den Inhalt der Vorfahrengene an wichtigen Knotenpunkten der Evolutionsreihe sowie die Anpassungsänderungen, die entlang der zu diesen Knotenpunkten führenden Zweige auftraten: Die größten Änderungen, die beim Vorhandensein und Fehlen von Orthogruppen beobachtet wurden, sind spezifisch für die Endlinien (Tabellen S8 und S9 in Zusatzdatei 1 und Abbildung 1). Mehr als dreimal so viele Orthogruppen-Zuwächse treten in der Linie auf, die zu allen Eudikotyledonen führt, im Vergleich zu den Kern-Eudikotyledonen (Abbildung S5 in Zusatzdatei 1), ein Anstieg, der nur von den Gräsern übertroffen wird.

Syntenie und Genomevolution

Eine wichtige evolutionäre Kraft, die die Genomarchitektur in Angiospermen prägt, ist die Verdopplung des gesamten Genoms (WGD). Auf diesen Prozess folgt die „Diploidisierung“ der Genomorganisation durch Umlagerung und des Geninhalts durch „Fraktionierung“ oder homöologischen Genverlust. Intragenomische Analysen von Lotus deuten darauf hin, dass es mindestens einen WGD (Paläotetraploidie, siehe Abbildung S6 in Zusatzdatei 1), genannt λ, gegeben hat, was jedoch bedeutet, dass die Nelumbo-Linie nicht γ, das Paläohexaploidie-(Verdreifachungs-)Ereignis vor etwa 125 Millionen Jahren, erlebt hat, das in allen anderen sequenzierten Eudicot-Genomen nachgewiesen wurde. Bei der Lotuspflanze sind gleich drei Post-γ-Subgenomkopien zu erkennen, deren syntenische Regionen eine starke Kollinearität homologer Gene aufweisen (Abbildung 2). Unter den 87,1 % der Lotos-Genregionen, die von dieser Duplikation erhalten blieben, sind 5.279 (33,3 %) Singletons, 8.578 (54,1 %) sind dupliziert und 2.007 (12,6 %) haben mehr als drei Homologe, was bedeutet, dass es zusätzliche Paläoduplikationen gegeben haben könnte (Tabelle S10 in Zusatzdatei 1).

Die Nukleotid-Substitutionsrate in der Lotuspflanze ist aufgrund ihrer basalen phylogenetischen Position in den Rosiden, der langsamen Mutationsrate und der fehlenden Reduplikation etwa 30 % langsamer als die der Weintraube, die in der vergleichenden Genomik der Angiospermen häufig verwendet wird. Erstens, während phylogenetische Beweise fest datiert die Lotus-Traube Divergenz vor der pan-eudicot γ Verdreifachung, die nur Traube, synonyme Substitutionsraten (Ks) zwischen Genom-weiten Lotus-Traube syntelog Paare (Abbildung S7 in zusätzliche Datei 1) sind kleiner als die unter triplicated Traubengene. Zweitens scheint die Mutationsrate der Lotus-Linie auch langsamer zu sein (etwa 29,26 % langsamer) als die von Vitis, basierend auf einem Maximum-Likelihood-Baum von 83 Plastiden-Genen und der Datierung der jeweiligen Speziationsereignisse durch Experten unter Verwendung des r8s-Programms mit bestrafter Likelihood. Drittens hat das Lotus-Genom nach seiner stammbaumspezifischen WGD mehr angestammte Loci bewahrt. Lotus ist eine basale Eudikotyledon und sein Genom ist das Genom der ältesten Angiospermenlinie, das bisher sequenziert wurde (Abbildung S1 in Zusatzdatei 1). Lotus stellt ein noch besseres Modell als Traube für Rückschlüsse auf den gemeinsamen Vorfahren der Eudikosen dar.

Die bemerkenswert langsame Mutationsrate in Lotus erschwert die Datierung der λ-Duplikation. λ-duplizierte Lotus-Gene haben eine mittlere synonyme Substitutionsrate (Ks) von 0,5428, was einem Alter von vor 27 Millionen Jahren (MYA) auf der Grundlage der durchschnittlichen Raten in Pflanzen oder 54 MYA auf der Grundlage der Traubenlinie Rate entspricht (Abbildung S7 in Zusatzdatei 1). Da sich der Lotus vor der γ-Verdreifachung von seiner engsten Schwesterlinie um etwa 135 bis 125 MYA trennte, deutet dies darauf hin, dass die Mutationsrate im Lotus viel niedriger ist als in der Traube und dass das lotusspezifische WGD-Ereignis vor etwa 65 MYA mit einer Spanne zwischen 76 und 54 MYA stattfand. Dieses Datum fällt mit dem kreidezeitlich-tertiären Massenaussterben zusammen, das zum Verlust von etwa 60 % der Pflanzenarten führte. Die Polyploidisierung wurde mit einer erhöhten Anpassungs- und Überlebensfähigkeit in Verbindung gebracht, und die zahlreichen Pflanzenarten, die sich in diesem Zeitrahmen polyploid entwickelt haben, deuten auf einen möglichen Vorteil für polyploide Linien während des Übergangs von der Kreidezeit zum Paläogen hin, eine Interpretation, die durch die λ-Duplikation im Lotus unterstützt wird.

Indem wir die phylogenetische Geschichte von 688 Genpaaren in 528 Orthogruppen aus jedem der γ-Duplikationsblöcke verfolgten, testeten wir den Zeitpunkt des γ-Paläohexaploid-Ereignisses, das in den Genomen von Vitis, Papaya, Populus und anderen Kern-Eudicots beobachtet wurde. Etwa 50 % der aufgelösten Bäume sprechen dafür, dass das γ-Ereignis nach der Divergenz von Lotus „core-eudicot-wide“ stattgefunden hat, was mit der Syntenieanalyse übereinstimmt. Im Gegensatz dazu enthalten die Genfamilien-Phylogenien für etwa die Hälfte der γ-Block-Duplikationen Lotus-Gene (Tabelle S11 in Zusatzdatei 1), obwohl in seltenen Fällen duplizierte monophyletische Gruppen sowohl Lotus- als auch Eudicot-weite Gene enthalten. Dies stimmt mit einer früheren phylogenomischen Analyse überein, bei der Daten von zahlreichen Pflanzengenomen und basalen Eudicot-Transkriptomen verwendet wurden, was darauf hindeutet, dass 18 % bis 28 % der γ-Blockduplikationen eudicot-weit waren, obwohl das Signal hauptsächlich in Kern-Eudicots beobachtet wird (Abbildung 3).

Solche Daten deuten darauf hin, dass eine relativ große Menge an genetischer Neuheit spezifisch mit Eudicots als Ganzes verbunden ist, obwohl die Kern-Eudicots nach der Divergenz von den basalen Eudicots eine Genomverdreifachung teilten. Im Gegensatz dazu scheint bei den Monokotyledonen die Evolution der Grasfamilie und nicht des früheren Knotens aus Gräsern (Poales) und Palmen (Arecales) mit relativ großen Zuwächsen bei der Anzahl und Größe der Genfamilien verbunden zu sein.

Anpassung an eine aquatische Umgebung

Das Wachstum von Pflanzen unter Wasser stellt besondere physiologische Herausforderungen dar. Lotus musste neue Eigenschaften entwickeln, um mit seiner aquatischen Lebensweise zurechtzukommen. Zu den möglichen Anpassungen gehört eine erstaunliche Anzahl mutmaßlich kupferabhängiger Proteine, von denen 63 Proteine mindestens eine COX2-Domäne, 55 eine „kupferbindende“ Domäne und 4 Polyphenoloxidasen enthalten. Die Häufigkeit von Kupferproteinen in Lotus im Vergleich zu anderen Pflanzen wird auf Erweiterungen in COG2132 zurückgeführt, einer Familie von Multi-Kupfer-Oxidasen. Die meisten Pflanzengenome kodieren für ein oder zwei Mitglieder von COG2132, während Lotus aufgrund von WGD und wiederholten Tandemduplikationen mindestens 16 Mitglieder aufweist (Abbildung 4 und siehe Abbildung S8 in Additional file 1). Die einzigen COG2132-Mitglieder in Arabidopsis, LPR1 und LPR2, sind an der Phosphatmangelsignalisierung in Wurzelmeristemen beteiligt. In ähnlicher Weise ist die Expression von Mitgliedern der COG2132-Familie bei Lotus weitgehend auf die Wurzeln beschränkt (Abbildung 4). Die lotus-spezifische Ausdehnung scheint eine von den LPR1- und LPR2-ähnlichen Proteinen getrennte phylogenetische Gruppe zu bilden, was auf eine neue Funktion hindeutet, die in Arabidopsis nicht vorkommt (Abbildung 4 und siehe Abbildung S8 in Additional file 1).

Die Anpassung an den Phosphatmangel bei Lotus wird auch durch die Expansion der UBC24-Familie und der miR399-Familie, die sie reguliert, belegt (Tabelle S12 in Zusatzdatei 1). Die miR169-Familie, die in Arabidopsis bei der Anpassung an Trockenstress eine Rolle spielt, ist bei Lotus ebenfalls vergrößert und umfasst insgesamt 22 Mitglieder. Die Tatsache, dass Lotus im Wasser wächst und nur selten Trockenheit ausgesetzt ist, deutet darauf hin, dass die miR169-Familie an anderen physiologischen Prozessen beteiligt ist.

Einige andere Genfamilien zeigen ebenfalls ungewöhnliche Zusammensetzungen, die die Anpassung an die aquatische Lebensweise widerspiegeln könnten. Der bHLH-Familie (basic helix loop helix), die an Lichtreaktionen wie der Keimung, der Kontrolle von Blüte und Austrieb sowie der Wurzel- und Blütenentwicklung beteiligt ist, fehlen bei Lotus drei ihrer 20 Unterfamilien: Va, das an der Brassinosteroid-Signalübertragung beteiligt ist, VIIIc2, das an der Wurzelhaarentwicklung beteiligt ist, und XIII, das an der Entwicklung des Wurzelmeristems beteiligt ist. Die größten Familien von bHLH-Faktoren in Lotus sind XII, die an Entwicklungsprozessen beteiligt sind, einschließlich der Kontrolle der Blütenblattgröße, der Brassinosteroid-Signalgebung und der Blüteninitiation, und Ia, die an der Stomatenentwicklung und -musterung beteiligt sind.

Die Familie der PRR1/TOC1-Zirkadianuhr, die die interne Biologie mit den täglichen Hell-Dunkel-Zyklen koordiniert und in vielen Pflanzenarten hoch konserviert ist, umfasst in Lotus drei vorausgesagte Mitglieder im Vergleich zu den ein oder zwei in anderen Pflanzengenomen. Die Tatsache, dass PRR-Proteine eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des Licht- und Temperatureinflusses auf die zirkadiane Uhr spielen, deutet darauf hin, dass Lotos möglicherweise empfindlichere Anpassungen an seine Umwelt benötigt als andere Pflanzen. In Übereinstimmung damit ist auch die Familie der Cryptochrome (CRY), der Photorezeptoren für blaues Licht, mit fünf (zwei CRY1, zwei CRY2, ein CRY3) im Vergleich zu drei in Arabidopsis und vier in Pappel vergrößert (Additional file 1, Tabelle S13). Eine ähnliche Expansion der CRY-Familie wurde auch bei einem anderen aquatischen Organismus, Ostreococcus, einer Mikro-Grünalge, festgestellt. Lotus ist sowohl an gemäßigte als auch an tropische Klimazonen und Tageslängen mit einem breiten Spektrum an Blütezeiten angepasst, was möglicherweise mit einer erhöhten Anzahl von Genen zusammenhängt, die mit der Blütezeit und der zirkadianen Uhr in Verbindung stehen.