Die Leishmaniose des Hundes (CanL) ist eine Protozoeninfektion/Krankheit, die durch Leishmania infantum (Synonyme: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi), die in allen Ländern des Mittelmeerraums, des Kaukasus und des Nahen Ostens der Alten Welt sowie in mehreren lateinamerikanischen Gebieten weit verbreitet ist (Dantas-Torres et al., 2012). Der Verlauf der Infektion bei Hunden reicht von subklinisch bis klinisch und von leichter bis schwerer Erkrankung. Obwohl der Parasit gelegentlich auf nicht-vektoriellem Weg übertragen werden kann (EFSA-Gremium für Tiergesundheit und Tierschutz, 2015), erfolgt die Übertragung hauptsächlich durch den Stich infizierter phlebotominer Sandmücken. Etwa 7 Tage nach einer infizierten Blutmahlzeit können kompetente Vektoren infektiöse Leishmania-Promastigoten im Vorderdarm entwickeln, die bei einer nachfolgenden Blutmahlzeit in die Haut des Säugetierwirts zurückgespuckt werden (Bates, 2007). Sowohl subklinische als auch erkrankte Hunde können für Vektoren infektiös sein; die Wahrscheinlichkeit, dass sie überproportional zur Weiterübertragung beitragen („Super-Spreader“-Effekt), steigt jedoch mit der Dauer und Schwere der CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus ist der wichtigste kompetente Vektor von L. infantum im gesamten westlichen Mittelmeerraum, einschließlich Südeuropa und Nordwestafrika (European Centre for Disease Prevention and Control, 2019). Darüber hinaus ist P. perniciosus ein repräsentatives Mitglied einer größeren taxonomischen Gruppe, der Untergattung Larroussius, die aus morphologisch, genetisch und biologisch eng verwandten Arten besteht, die im zentralen und östlichen Mittelmeerraum als kompetente Vektoren von L. infantum fungieren, wie Phlebotomus neglectus und Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). Der Einsatz von topischen Pyrethroiden gilt allgemein als erste Wahl zum Schutz gesunder Hunde vor Leishmania-infizierten Sandmückenstichen (Maroli et al., 2010), wohingegen das Management infizierter/infizierter Hunde eine komplexe Aufgabe darstellt, da es keinen breiten Konsens über die zu verfolgende Vorgehensweise gibt. Idealerweise sollte die individuelle tierärztliche Betreuung zur Behandlung der CanL-Pathologie mit Maßnahmen kombiniert werden, die darauf abzielen, die Verbreitung des Parasiten über den Vektor zu verhindern. Letzteres ist im Rahmen der Programme zur Bekämpfung der zoonotischen VL, die derzeit in mehreren endemischen Ländern durchgeführt werden, besonders wichtig. Einerseits zögern Besitzer, in Pyrethroidprodukte für bereits infizierte oder kranke Hunde zu investieren; andererseits sind antileishmanische Therapien nur vorübergehend wirksam, um die Infektiosität eines Hundes für Sandmücken dauerhaft zu reduzieren (Miró et al., 2017). Isoxazoline sind eine neue Klasse von Wirkstoffen, die auf das zentrale Nervensystem und die neuromuskulären Verbindungen von Arthropoden abzielen, indem sie ligandengesteuerte Chloridkanäle blockieren und so den Tod der Arthropoden verursachen (Weber & Selzer, 2016). Eine Reihe von Verbindungen wurde als Tierarzneimittel für den Schutz von Haustieren gegen Flöhe und Zecken zugelassen, mit langen In-vivo-Halbwertszeiten, die nach einmaliger oraler Verabreichung Wochen bis Monate Schutz bieten (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Diese Eigenschaften haben die Aufmerksamkeit auf die potenzielle Verwendung von Isoxazolinen zur Bekämpfung von durch Vektoren übertragenen Krankheiten beim Menschen gelenkt (Miglianico et al., 2018). In Bezug auf fliegende Insekten wurde festgestellt, dass sich die im Handel erhältlichen Isoxazoline bei der Verabreichung an Hunde sowohl im Grad als auch in der Dauer der insektiziden Wirksamkeit unterscheiden, z. B. gegen Triatoma infestans (Loza et al., 2017) oder die Sandfliege Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a), wobei sich Fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) im Hinblick auf die oben genannten Wirksamkeitsparameter als die aktivste Verbindung erwies. Kürzlich wurde in einer klinischen Studie zur Behandlung von Hunden mit Fluralaner gegen Sandmücken eine kolonisierte P. papatasi als Zielspezies verwendet (Gomez et al., 2018b). Diese Spezies kann jedoch nicht als geeignetes Sandfliegenmodell angesehen werden. Dies liegt vor allem daran, dass P. papatasi kein kompetenter Überträger von L. infantum ist, da sie für die Entwicklung dieses Parasiten im Darm refraktär ist. Darüber hinaus deuten frühere Studien zu topischen Pyrethroiden für Hunde (Maroli et al., 2010) darauf hin, dass P. papatasi weniger empfänglich für Wirkstoffe sein könnte, die auf das zentrale Nervensystem der Sandfliege abzielen, als P. perniciosus. Beispielsweise tötete eine Spot-on-Formulierung aus 50 % Permethrin und 10 % Imidacloprid 29 % P. papatasi gegenüber 49 % P. perniciosus. Diese Überlegungen veranlassten uns, den Beginn und die Dauer der insektiziden Wirksamkeit gegen P. perniciosus nach der Fütterung von mit Fluralaner behandelten Hunden zu bestimmen.

Eine parallel angelegte, negativ kontrollierte, randomisierte, verblindete, einzentrische Wirksamkeitsstudie wurde durchgeführt. Die Versuchshunde, bestehend aus männlichen Beagles, die zum Zeitpunkt des Einschlusses ≥ 6 Monate alt waren, stammten aus einer Forschungskolonie in Mohammedia, Marokko; die Studie in der Lebensphase wurde in den Einrichtungen von Clinvet durchgeführt. Adulte P. perniciosus-Exemplare stammten von einem spanischen Stamm, der seit Juni 2012 in den Einrichtungen für medizinische Entomologie des Istituto Superiore di Sanità, Italien, bei 28 ± 1 °C und 75-80 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wurde. Die Sandmücken wurden als pathogenfrei zertifiziert und an die Bedingungen der Massenvermehrung mit sechs unabhängigen Kolonie-Sublinien angepasst. Drei bis neun Tage alte Exemplare wurden aus den jeweiligen Aufzuchtkäfigen gepoolt und in ähnlichen Altersverhältnissen in zylindrische Kunststofftöpfe (400 ml) verteilt, die mit einem dichten Deckel versehen waren, der durchlöchert und das Loch mit einer feinen Gaze abgedeckt war, in der sich ein mit glukosegesättigter Lösung getränktes Stück Baumwolle befand. Die Anzahl der Sandfliegen in jedem Topf reichte für einen Hund aus, wobei einige zusätzliche Exemplare hinzugefügt wurden, um Todesfälle vor den Versuchen auszugleichen. Die Töpfe wurden in luftdichte Plastikbeutel mit befeuchtetem Filterpapier gelegt. Die Sekundärverpackung bestand aus einem vorgewärmten Behälter, der mit einer erweiterten Temperaturstabilitätsvorrichtung und einem digitalen Temperaturschreiber ausgestattet war und von einer stabilen Kartonschachtel umgeben war. Die Kisten wurden auf dem Luftweg nach Marokko versandt, und die Lieferung erfolgte innerhalb von etwa 3 Tagen nach dem Versand. Bei der Lieferung wurde die Temperaturaufzeichnung überprüft, und die Plastikbeutel wurden ungeöffnet bei 25 ± 3 °C belassen, bis die Hunde ausgesetzt wurden. Eine grobe Einschätzung der Mortalität der Sandfliegen in den Töpfen wurde von außen vorgenommen, und eine Mortalitätsrate von ≤ 10 % pro Topf wurde als akzeptabel für die Verwendung angesehen. Letztlich wurde jeder Hund zum Zeitpunkt der Versuche derselben homogenen Population von Sandfliegen ausgesetzt, die 7-14 Tage alt waren.

Siebenundzwanzig Tage vor der Behandlung wurden 14 männliche Beagle-Hunde mit Domitor® (Vetoquinol, Lure, Frankreich) sediert, und ihr Kopf wurde eine Stunde lang den Bissen von etwa 40 in Käfigen gehaltenen P. perniciosus-Weibchen ausgesetzt, zusammen mit fünf Männchen, um das Bissverhalten zu fördern, mit dem Ziel, die individuelle Attraktivität für den Vektor unter diesen Versuchsbedingungen zu bewerten. Die Hunde wurden in absteigender Reihenfolge nach der Anzahl der mit Blut gefütterten Lebendproben geordnet; zwei Hunde mit den niedrigsten Werten wurden von der Studie ausgeschlossen, und zwölf Hunde wurden in die Studie aufgenommen und zwei Gruppen mit je sechs Hunden (Gruppe 1 und 2) zugeteilt. Am Tag 0 wurden die Hunde der Gruppe 2 mit einer oralen Dosis Fluralaner (Bravecto®-Kautabletten) in der angegebenen Dosierung von 25 bis 56 mg/kg Körpergewicht behandelt, während die Hunde der Gruppe 1 unbehandelt blieben. Spezifische Gesundheitsbeobachtungen wurden 1, 2 und 6 Stunden nach Verabreichung von Fluralaner an den letzten Hund durchgeführt. Die Exposition von Hunden gegenüber etwa 40-60 P. perniciosus-Weibchen (plus 5-10 Männchen) erfolgte parallel für beide Gruppen bei ähnlichen Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen in zwei Räumen an den Tagen 1, 28 und 84 (eine Zwischenbewertung wurde ursprünglich für den Zeitraum von etwa 50-60 Tagen nach der Behandlung erwogen, was jedoch aufgrund technischer und logistischer Probleme nicht möglich war). Das primäre Kriterium für die Bestimmung der Wirksamkeit war die Überlebensrate von Sandmücken, die vollständig mit behandelten Hunden gefüttert wurden, im Vergleich zu denen, die vollständig mit Kontrollhunden gefüttert wurden; teilweise oder geringfügig mit Blut gefütterte Exemplare wurden nicht berücksichtigt. Um optimale und dauerhafte Vergleiche zwischen den beiden Gruppen von Sandfliegenexemplaren zu ermöglichen, wurden die Weibchen einzeln aus den Expositionskäfigen durch sanftes Absaugen mit dem Mund entnommen und in Gruppen von ≤ 10 Exemplaren in mit Gips ausgekleideten Plastiktöpfen zusammengefasst. Die Töpfe wurden dann in Kästen mit gesättigter Glukose und befeuchtetem Filterpapier gestellt und anschließend bei 26 °C gehalten. Die Lebensfähigkeit wurde nach 6 Stunden (außer an Tag 1) und dann in Abständen von 24 Stunden bis maximal 96 Stunden nach dem Ende der Exposition bewertet. Um die allgemeine Lebensfähigkeit der in jedem Experiment verwendeten Sandfliegen-Charge zu bewerten, wurden die oben beschriebenen Verfahren sowohl auf gefütterte als auch auf ungefütterte Weibchen angewandt.

Die statistische Signifikanz der Ergebnisse der insektiziden Wirksamkeit, ausgedrückt als der Anteil der lebenden gefütterten Sandfliegen aus Gruppe 2 im Vergleich zu denen aus Gruppe 1, wurde unter Verwendung eines linearen gemischten Modells berechnet, das die Versuchsgruppe als festen Effekt und einen Randomisierungsblock als zufälligen Effekt einschließt, wobei das Signifikanzniveau auf α = 0,05 (zweiseitig) festgelegt wurde. Das Modell verwendete die Kenward-Rogers-Anpassung, um die Freiheitsgrade des Nenners zu bestimmen.

Am Tag 1 wurden 78 blutgefütterte Proben von insgesamt 159 lebenden Weibchen, die von Hunden der Gruppe 2 entnommen wurden, gegenüber 64 blutgefütterten Proben/169 lebenden Weibchen von Hunden der Gruppe 1 ausgewertet. Am 28. Tag wurden 199/341 lebende Weibchen aus Gruppe 2 ausgewertet, gegenüber 146/310 aus Gruppe 1. Am 84. Tag waren es 240/326 aus Gruppe 2 bzw. 206/339 aus Gruppe 1, die mit Blut gefüttert wurden. Tabelle 1 zeigt den mittleren Anteil der überlebenden P. perniciosus nach der Blutmahlzeit bei behandelten und unbehandelten Hunden. Am ersten Tag nach der Behandlung gab es Hinweise auf einige Todesfälle unter den verschlungenen Sandfliegen, die bereits zum Zeitpunkt der Entnahme aus den Käfigen der Gruppe 2 zu verzeichnen waren, jedoch keine aus denen der Gruppe 1. 24 Stunden nach der Blutmahlzeit waren alle Exemplare der Gruppe 2 tot, im Gegensatz zu 11 % der blutgefütterten Exemplare der Gruppe 1. Am 28. Tag war die Überlebensrate der mit Hunden der Gruppe 2 gefütterten Exemplare bereits 6 Stunden nach der Blutmahlzeit signifikant niedriger als die der Exemplare aus Gruppe 1; auch hier waren alle mit Blut gefütterten Exemplare aus Gruppe 2 nach 24 Stunden tot, im Gegensatz zu 3 % der mit Blut gefütterten Exemplare aus Gruppe 1. Am 84. Tag überlebte eine Reihe von Exemplaren, die mit behandelten Hunden gefüttert worden waren, bis zum Ende der Beobachtungen, mit großen Schwankungen innerhalb der Gruppen; ihre Überlebensrate nahm ab 24 h ab und war ab 48 h signifikant niedriger im Vergleich zu Exemplaren, die mit Kontrollhunden gefüttert worden waren, mit einer berechneten insektiziden Aktivität von über 50% bis zu 96 h der Beobachtung.

Die Überlebensraten von nicht gefütterten Sandfliegen, die aus den Expositionskäfigen wieder eingesammelt wurden, wurden ebenfalls bis zu 96 Stunden nach der Exposition jedes Hundes bewertet. Sie waren im Allgemeinen erhöht und höher als bei den mit Blut gefütterten Exemplaren, wobei es einige Unterschiede zwischen den einzelnen Tagen der Exposition eines Hundes gab, wenn auch nicht so sehr zwischen den Versuchsgruppen bei jeder Exposition. Dies könnte auf chargenweise Schwankungen in der Sterblichkeit zurückzuführen sein, die typischerweise zwischen den Generationen der kolonisierten Sandmücken auftreten, sowie möglicherweise auf unterschiedliche Transportbedingungen. Die Blutaufnahme war die einzige Variable, die mit einer 100%igen Sandfliegensterblichkeit bei mit Fluralaner behandelten Hunden verbunden war (Abb. 1).

Die vorliegende Studie, auch wenn sie nicht verschiedene Sandfliegenarten vergleicht, liefert weitere Beweise dafür, dass die Empfindlichkeit gegenüber Insektizidprodukten für Hunde, die auf das zentrale Nervensystem der Sandfliege abzielen, bei P. perniciosus höher sein könnte als bei P. papatasi. Unter Verwendung der gleichen Fluralaner-Formulierung und -Dosierung in einer Studie mit Beagles, die dieser Spezies ausgesetzt waren, verzeichneten Gomez et al. (2018b) ein teilweises Überleben von blutgefütterten P. papatasi-Weibchen (in der Größenordnung von 6-7 %) bereits 17-31 Tage nach der Behandlung, das sich auf etwa 25 % an Tag 45 erhöhte.

Es gibt eine > 5-tägige Verzögerungszeit, bis eine Sandfliege nach der Aufnahme einer infizierten Blutmahlzeit infektiös ist. Daher besteht eine technische Herausforderung bei Studien mit systemischen Insektiziden bei Sandmücken darin, eine hohe und dauerhafte Überlebensrate von blutgefütterten Kontrollproben aufrechtzuerhalten und etwaige verzögerte insektizide Wirkungen nachzuweisen, die noch ein übertragungshemmendes Potenzial haben. Diese Herausforderung unterscheidet sich von den meisten üblichen Studien mit Behandlungen zur Verhinderung der Nahrungsaufnahme, bei denen die Sandmücken unmittelbar nach der Exposition eines Hundes von den Versuchsleitern getötet und als blutgesättigt/ungesättigt eingestuft werden. Langfristige Auswertungen sind erforderlich, um eine sinnvolle Interpretation und statistische Signifikanz der Überlebensunterschiede zwischen behandelten und Kontrollgruppen zu gewährleisten (z. B. während der absteigenden Phase der Wirkstoffkonzentrationen im Hundeplasma). Die Verwendung von Ex-vivo-Hundeblut sowohl von behandelten als auch von Kontrollhunden in künstlichen Fütterungssystemen kann anfällig für bakterielle Verunreinigungen sein und daher zu einem schnellen Absterben aller verstopften Sandmücken führen, was nur ein enges Zeitfenster für die Unterscheidung zwischen aktiven und nicht aktiven Medikamenten erlaubt (Gomez et al., 2018a). In der vorliegenden Studie war die Überlebensrate der mit Blut gefütterten Kontrollexemplare sehr zufriedenstellend, mit einer Spanne von 61-81 % nach 96 Stunden nach der Blutmahlzeit.

Die Pharmakokinetik von Fluralaner im Hundeplasma nach einer einmaligen oralen Verabreichung zeigte einen regelmäßigen absteigenden Trend bis etwa 100 Tage nach der Behandlung, wenn es nicht mehr nachweisbar ist (Kilp et al., 2014). Interessant ist, dass ein theoretischer Mittelwert von etwa 40-100 ng Fluralaner/ml Plasma, der 84 Tage nach der Behandlung erreicht wurde, immer noch in der Lage war, > 50 % von P. perniciosus innerhalb von 48 Stunden nach einer Blutmahlzeit zu töten. Daher ist es wahrscheinlich, dass auch intermediäre Plasmakonzentrationen, wie sie zwischen 28 und 84 Tagen nach der Behandlung zu erwarten sind, eine erhöhte insektizide Aktivität gegen den Vektor aufweisen, und daher sind neue Studien erforderlich, um dies zu bestätigen. Andererseits zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie in Bezug auf die drei Zeitpunkte eindeutig einen kohärenten Trend zur Verringerung der Wirksamkeit während der gesamten Studie.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung von Hunden mit Fluralaner eine vielversprechende Methode zur Reduzierung des Pools infizierter Vektoren in endemischen Gebieten mit zoonotischer VL darstellt. Darüber hinaus könnte die Verwendung von Fluralaner in Kombination mit präventiven topischen Pyrethroid-Behandlungen, sofern dies nicht für die Sicherheit des Hundes kontraindiziert ist (Walther et al., 2014), Vorteile für Hunde in Hochrisikogebieten bieten.