Strategien bei der Regulierung unterschiedlich reagierender Gene

Die Mechanismen der Genregulierung durch Morphogensignale müssen ein Mittel bereitstellen, um kleine Unterschiede in der Signalstärke in Schwellenwertreaktionen zu übersetzen, bei denen alles oder nichts in der Genexpression die Auswahl diskreter Zellidentitäten in dem sich entwickelnden Gewebe ermöglicht. Vor mehr als einer Generation wurden Strategien vorgeschlagen, die dieses Phänomen erklären könnten (Monod und Jacob, 1961), und einige dieser Ideen tauchen in neueren molekularen Studien wieder auf. Wir versuchen, diese Strategien in allgemeine Konstruktionsmerkmale zu kategorisieren, die die unterschiedliche Genregulation durch Gradedsignaling erklären können (Abb. 2). Natürlich gibt es Überschneidungen zwischen diesen Kategorien, und die Liste ist nicht erschöpfend. Es ist offensichtlich, dass die meisten, wenn nicht sogar alle der gut untersuchten Morphogenwege eine Kombination dieser Mechanismen zur Steuerung der Zielgenexpression verwenden. Zur Veranschaulichung der wichtigsten Merkmale der einzelnen Strategien haben wir Beispiele für ihre Verwendung bei der Interpretation spezifischer Morphogengradienten skizziert.

Bindungsstellenaffinität

Ein wichtiger Mechanismus, der ausgiebig untersucht wurde, nutzt Unterschiede in der Affinität des Transkriptionseffektors für die Bindung an Stellen mit unterschiedlichen DNA-Sequenzen aus (Abb. 2A). Ein Paradigma hierfür ist der Dl-Gradient im frühen Drosophila-Embryo, der die DV-Musterung und Gastrulation durch die konzentrationsabhängige Aktivierung und Unterdrückung von Zielgenen steuert (Stathopoulos und Levine, 2004). Ausführliche Untersuchungen spezifischer Enhancer, die auf unterschiedliche Schwellenwerte von Dl reagieren, haben ein detailliertes Bild des Mechanismus der Genregulation ergeben. Auf der Grundlage ihrer Reaktionsfähigkeit auf Dl wurden die Zielgene in verschiedene Kategorien eingeteilt. Gene des Typs I, wie z. B. Twist (twi), werden im präsumptiven Mesoderm aktiviert, wo die Kerndosis von Dl am höchsten ist (Abb. 1C). Die Enhancer dieser Gene verfügen in der Regel über Dl-Bindungsstellen mit geringer Affinität, die nur bei der höchsten Dl-Konzentration besetzt sind, wodurch die Expression von Genen des Typs I auf das präsumptive Mesoderm beschränkt wird (Jiang und Levine, 1993). Im Vergleich dazu enthalten Enhancer von Genen des Typs II, wie z. B. Rhomboid (Abb. 1C), Dl-Bindungsstellen mit hoher Affinität, die von den niedrigeren Dl-Konzentrationen, die im ventralen Neuroektoderm vorhanden sind, gebunden und aktiviert werden (Ip et al., 1992a). Eine kürzlich durchgeführte computergestützte Analyse eines großen Satzes von auf Dl reagierenden Enhancern aus den Genomen von D. melanogaster und verwandten Arten hat bestätigt, dass die Dl-Affinität eine wichtige Determinante für die Expressionsdomänen von Dl-Zielgenen ist (Papatsenko und Levine, 2005). In einigen Fällen kann Dl, das an eine Stelle mit hoher Affinität gebunden ist, auch die Transkription unterdrücken, was darauf hindeutet, dass die Enhancer-Architektur ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Reaktionsfähigkeit von Genen auf Dl spielt (Stathopoulos und Levine, 2004). Darüber hinaus beeinflussen kooperative Interaktionen zwischen Dl und anderen Faktoren die Reaktionsfähigkeit einiger Gene ebenfalls erheblich.

Ein zweites Beispiel ist die Interpretation des Bcd-Gradienten, der für die Regulierung der Genaktivität entlang der anteroposterioren (AP) Achse im Drosophila-Embryo verantwortlich ist. In frühen Studien zur Interpretation von Bcd wurde die Affinität der Bcd-Bindungsstellen als Schlüsselfaktor für die Festlegung der Grenzen der Expression des hb-Zielgens identifiziert (Abb. 1B). Eine abnehmende Bcd-Affinität führt zu einem stärker anterior begrenzten Expressionsmuster, in dem die Bcdlevel höher sind. Daher wurde ein Modell für die Interpretation des Bcd-Gradienten vorgeschlagen, bei dem Gene mit anterior eingeschränkter Expression Bcd-Bindungsstellen mit geringer Affinität in ihrem Enhancer aufweisen und folglich eine hohe Bcd-Konzentration für die Belegung und Aktivierung benötigen. Umgekehrt ermöglichen die Stellen mit höherer Affinität im hb-Enhancer die Expression an weiter posterioren Positionen, wo die Bcd-Konzentration niedriger ist (Driever et al., 1989; Struhl et al., 1989). Zur Unterstützung dieses Modells weist das Orthodentikel-Gen, das durch einen Enhancer mit geringer Bcd-Affinität reguliert wird, ein enges Expressionsmuster auf (Gao et al., 1996) (Abb. 1B).

Nicht nur im präzellulären Embryo erfolgt die Reaktion von Genen auf eine abgestufte Transkriptionsfaktoraktivierung über die Affinität der Bindungsstellen. Dieser Mechanismus ist auch in konventionelleren Situationen nach der Zellularisierung von Bedeutung, wie etwa bei der Interpretation des extrazellulären Dpp-Gradienten im Drosophila-Embryo. Als Reaktion auf die Spitzenwerte der Dpp-Signalisierung an der dorsalen Mittellinie des Embryos wird das Zielgen Race in einem schmalen Streifen von Zellen in der präsumptiven Amnioserosa exprimiert (Abb. 1D). Der für diese Aktivität verantwortliche Enhancer enthält Bindungsstellen mit geringer Affinität für Mad, den transkriptionellen Effektor von Dpp. Wenn diese Stellen verändert werden, um die Affinität für Mad zu erhöhen, erweitert sich das zugehörige Expressionsmuster zu einem Muster, das für Gene charakteristisch ist, die auf eine niedrigere Schwelle der Dpp-Signalisierung reagieren (Wharton et al., 2004).

Kombinatorische Inputs

Die Affinität der Bindungsstellen kann einen Teil der Ausgänge des Morphogengradienten erklären; im Allgemeinen reicht die Affinität allein jedoch nicht aus, um die gesamte Palette der transkriptionellen Reaktionen zu steuern. Obwohl beispielsweise die Affinität der Bcd-Bindungsstellen die Grenzen der Expression des hbt-Zielgens festlegt (Driever et al., 1989; Struhl et al., 1989), zeigt eine rechnerische Untersuchung einer größeren Stichprobe von Bcdcis-Regulationsmodulen, dass für die meisten eine schwache Korrelation zwischen der Stärke der Bcd-Bindungscluster und den Expressionsgrenzen eines Gens besteht. Darüber hinaus scheinen nur wenige Zielgene allein durch Bcd aktiviert zu werden, und die Expression dieser Gene ist auf die vordersten Teile des Embryos beschränkt, in denen die Bcd-Spiegel am höchsten sind (Ochoa-Espinosa et al., 2005), wie dies bei einem synthetischen Reporter beobachtet wurde, der nur Bcd-Bindungsstellen enthält (Crauk und Dostatni, 2005).Bei vielen Genen ist die absolute Bcd-Affinität nicht die wichtigste Determinante für die Interpretation der Positionsinformationen. Stattdessen können andere Elemente in den Genpromotoren und die Integration positiver und negativer Transkriptionsbeiträge von Proteinen, die an diese Elemente gebunden sind, die Interpretation des Bcd-Gradienten bestimmen. Bei Genen, die in den mittleren und hinteren Regionen des Embryos aktiviert werden, neigen die meisten Enhancer von Bcd-Zielgenen dazu, zusätzlichen Input von den Transkriptionsfaktoren Hb, Caudal (Cad) und/oder Krüppel (Kr) zu erhalten (Ochoa-Espinosa et al., 2005). Hb und Cad werden maternal exprimiert und zygotisch durch Bcd auf der Transkriptions- bzw. Translationsebene aktiviert und unterdrückt (Driever und Nusslein-Volhard, 1989; Dubnau und Struhl, 1996; Rivera-Pomaret al., 1996). Sowohl Hb als auch Cad verstärken die Bcd-abhängige Transkriptionsaktivierung (La Rosee etal., 1997; Simpson-Brose etal., 1994). Daher könnte der Bcd-Gradient zusammen mit Hband und/oder Cad eine breite Domäne bilden, in der eine Enhancer-Aktivierung stattfinden kann, und das Gleichgewicht der positiven und/oder negativen Inputs dieser und anderer Transkriptionsfaktoren würde die Grenzen einer Expressionsdomäne bestimmen (Ochoa-Espinosa et al., 2005).Der transkriptionelle Repressor Kr könnte ein solcher negativer Input sein, der die scharfe hintere Grenze einiger Bcd-Ziele bildet (Kraut und Levine, 1991). Ebenso wie die Bindungsstellen für andere Transkriptionseffektoren beeinflusst auch die Anordnung der Bcd-Bindungsstellen die Genexpression, und die Daten deuten darauf hin, dass Bcd kooperativ an die DNA bindet. Daher verstärkt die Bindung von Bcd an eine Stelle mit hoher Affinität die Bindung an eine benachbarte Stelle mit niedriger Affinität (Burz et al., 1998). Die Expression eines Bcd-Proteins mit einer Mutation, die die Kooperativität im Embryo unterbricht, führt zu einer anterioren Verschiebung der Expressionsmuster von Zielgenen, wie z.B. ashb, und zu einer verringerten Schärfe ihrer posterioren Grenzen (Lebrecht et al., 2005).

Die Integration von Inputs von Dl und von anderen Transkriptionsfaktoren beeinflusst auch die Antwort von Genen entlang der DV-Achse des Drosophila-Embryos. Eine Analyse von Dl-Zielgen-Enhancern in verschiedenen Drosophiliden (Papatsenko und Levine, 2005) hat ergeben, dass Schwellengene vom Typ I tendenziell eine geringere Dlaffinität aufweisen als Typ-II-Gene, und dass bei diesen Promotoren eine ähnliche Tendenz hinsichtlich der Affinität eines anderen Transkriptionsfaktors, Twi, besteht. Außerdem haben Schwellenwerte vom Typ II eine feste Ausrichtung und einen festen Abstand zwischen den Dl- und Twi-Stellen. Dies steht im Einklang mit dem Auftreten von synergistischen Interaktionen zwischen den Transkriptionsfaktoren Dl und Twi, die für die Aktivierung von Typ-II-Zielen im Neurektoderm wichtig sind, wo die Dl- und Twi-Spiegel niedrig sind (Papatsenko und Levine, 2005).Typ-II-Enhancer haben in der Regel einen zusätzlichen positiven Input durch den Aktivator Suppressor of Hairless (Erives und Levine, 2004) und einen negativen Input durch den Repressor Snail. snail ist ein Dl-Zielgen, das im präsumptiven Mesoderm aktiviert wird (Ip et al, 1992b), wodurch die Expression von Typ-II-Genen aus dem Mesoderm ausgeschlossen wird (Kosman et al., 1991). Im Gegensatz zu den Typ-II-Enhancern besteht bei den Typ-I-Enhancern eine negative Korrelation zwischen der Qualität der Dl- und Twi-Stellen, d. h. eine gute Dl-Stelle ist mit einer schlechten Twi-Stelle assoziiert und umgekehrt. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivatoren an denjenigen Enhancern, an denen es Spitzenwerte von Dl und Twi gibt, kompensatorisch wirken (Papatsenko und Levine, 2005). Studien mit synthetischen Enhancern zeigen außerdem, dass das Vorhandensein von Twi- und Dl-Stellen zu einem schärferen Expressionsmuster führt, im Vergleich zu dem schwächeren, unscharfen Muster, das mit Dl allein beobachtet wird (Szymanski und Levine, 1995). Somit ist klar, dass neben der Affinität der Bindungsstellen für den wichtigsten Transkriptionseffektor eines Morphogens die Integration positiver und negativer Inputs in einen Enhancer eine wichtige Determinante der Schwellenwertreaktionen ist (Abb. 2B).

Feed-forward-Schleifen

Die Einbeziehung kombinatorischer Inputs in die Kontrolle der differentiellen Genexpression ermöglicht die Entwicklung komplexer regulatorischer Beziehungen zwischen den entsprechenden Genen. Eine solche Beziehung ist die Feed-forward-Schleife (Abb. 2C), deren Beispiel kürzlich für die Aktivierung von Race durch Dpp-Signale beschrieben wurde. Neben der Affinität der Mad-Bindungsstellen im Race-Enhancer (Wharton et al., 2004) spielt der Transkriptionsfaktor Zerknüllt (Zen) eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von Race. Zen und Mad binden an benachbarte Stellen im Race-Enhancer, und eine direkte Interaktion zwischen ihnen ist für die Aktivierung von Race erforderlich (Xuet al., 2005). zen ist selbst ein Dpp-reguliertes Gen, das von Spitzenwerten der Dpp-Signalisierung abhängig ist (Rushlow et al., 2001). Damit Race induziert werden kann, müssen also Spitzenwerte der Dpp-Signalisierung hohe Werte von Mad aktivieren und die Expression von Zen induzieren, die zusammen die Aktivierung von Race bewirken (Xu et al., 2005). Diese Art von regulatorischem genetischem Netzwerk, in dem der Transkriptionsfaktor X den Transkriptionsfaktor Y aktiviert und X und Y gemeinsam das Ziel Z aktivieren, wird als Feed-forward-Schleife bezeichnet (Lee et al., 2002).

Die Mad-Zen-Feed-forward-Schleife könnte eine allgemeine Strategie darstellen, die zur Aktivierung anderer Dpp-Zielgene verwendet wird (Xu et al., 2005). Es ist sicher der Fall, dass Feed-Forward-Schleifen auch in anderen auf Morphogene reagierenden Gennetzwerken funktionieren. So wird beispielsweise Twi, das zusammen mit Dl Gene entlang der DV-Achse reguliert, selbst von einem Dl-responsiven Gen kodiert (Jiang und Levine, 1993). Das Vorkommen von Feed-Forward-Schleifen bei der Interpretation von Morphogengradienten in frühen Drosophila-Embryonen deutet darauf hin, dass diese Art von Regelkreisen für die Interpretation von Gradienten besonders geeignet ist. Daten aus anderen Systemen zeigen, dass Feed-Forward-Schleifen nützlich sind, um zwischen unregelmäßigen externen Signalen zu unterscheiden, um sicherzustellen, dass die Aktivierung nur als Reaktion auf anhaltende Signale erfolgt, und somit ein Mittel zur Abfederung kleiner Signalschwankungen bereitzustellen (Shen-Orr et al., Darüber hinaus kann das Koinzidenzerfordernis, das Feed-Forward-Schleifen innewohnt, auch hochempfindliche Reaktionen auf kleine Änderungen des Signalpegels ermöglichen (Goldbeter und Koshland, 1984), eine Eigenschaft, die es ermöglichen würde, Schwellenreaktionen als Reaktion auf kleine Änderungen der ursprünglichen Signalstärke zu erzeugen.

Positive Rückkopplung

Die Autoregulation oder positive Rückkopplungsschleifen (siehe Abb. 2D) in reagierenden Genen können ebenfalls eine Rolle bei der Interpretation von Gradienten spielen und einen Mechanismus für die Erzeugung von Ganz-oder-gar-nicht-Antworten bei Schwellenwerten von Signalen bieten. Ein gut charakterisiertes Beispiel hierfür ist die Regulation von Hoxb4 im Hinterhirn von Wirbeltieren (Gould et al., 1998; Gould et al., 1997). Ein Gradient von Retinsäure (RA) verleiht Positionsinformationen entlang der AP-Achse des sich bildenden Wirbeltierhinterhirns und ist für die Bestimmung der vorderen Grenze der Induktion von Hoxb4 verantwortlich. RA aktiviert nukleäre RA-Rezeptoren (RARs), und diese Rezeptoren binden an eine definierte Enhancer-Region im Hoxb4-Locus, um dessen Expression zu aktivieren. In frühen Stadien der Hinterhirnentwicklung führt dieser Mechanismus zu einer diffusen anterioren Expressionsgrenze von Hoxb4. Ein zweites Verstärkerelement, das späte Verstärkerelement, innerhalb des Hoxb4-Lokus reagiert auf das Hoxb4-Protein selbst. Daher reagiert dieses Element in späteren Entwicklungsstadien nach der RA-vermittelten Induktion von Hoxb4 auf das induzierte Hoxb4 und ist ausreichend, um die Expression dieses Gens bis zur normalen vorderen Grenze der Genexpression zu lenken. Die abgestufte RA-Aktivität initiiert also die Hoxb4-Expression, die Hoxb4-vermittelte Autoregulation durch Hoxb4 verfeinert die Expression und erhält sie im Verlauf der Hinterhirnentwicklung aufrecht. Hoxb4 reguliert RARβ in ähnlicher Weise, was darauf hindeutet, dass zwischen diesen Proteinen ein wechselseitiger positiver Rückkopplungskreis besteht, der die diskreten Grenzen der Hoxb4-Expression erzeugt und aufrechterhält (Serpente et al., 2005).

Kreuzrepression

Repressive Interaktionen zwischen morphogen-regulierten Genen sind ebenfalls wichtig für die Interpretation des Gradienten (Abb.2E). Ein gut untersuchtes Beispiel ist der Beitrag der Kreuzrepression zur Aufteilung des Neuroektoderms von Drosophila in drei Spalten entlang der DV-Achse (Cowden und Levine, 2003). Diese Unterteilung wird durch drei Homeoboxtranskriptionsfaktoren (Vnd, Ind und Msh) vermittelt, die die ventralen, intermediären bzw. dorsalen Spalten abgrenzen. Unterschiedliche Schwellenwerte der D-Signalisierung induzieren diese Gene, aber die Produktion der verschiedenen Spalten der Genexpression, die durch abrupte Schalter in der Expression jedes Homeodomain-Proteins abgegrenzt sind, hängt von asymmetrischen kreuzregulatorischen Interaktionen zwischen diesen Proteinen ab. Auf diese Weise unterdrücken die Homeodomain-Proteine, die in den ventraleren Bereichen exprimiert werden, die Proteine, die weiter dorsal exprimiert werden. Auf diese Weise führen schrittweise Erhöhungen der Dl-Signalisierung zu einer sequentiellen Aktivierung jedes Gens und zu einer entsprechenden Unterdrückung der Gene, die durch niedrigere Dlaktivität induziert werden – ein Prozess, der als „ventrale Dominanz“ bezeichnet wird.

Das Nervensystem der Wirbeltiere weist eine Variation dieses regulatorischen Motivs auf, bei dem es zu einer gegenseitigen Unterdrückung oder einer wechselseitigen negativen Rückkopplung zwischen Genpaaren kommt. Die Zellen im Neuralrohr der Wirbeltiere reagieren auf abgestufte Shh-Signale, indem sie die Expression einer Reihe von Transkriptionsfaktoren regulieren, zu denen die Homöodomänen-Orthologe von Vnd, Ind und Msh gehören (Briscoe und Ericson, 2001). Diese Transkriptionsfaktoren werden aufgrund der Art ihrer Regulierung durch Shh-Signale in zwei Gruppen unterteilt, die als Klasse-I- und Klasse-II-Proteine bezeichnet werden. Die Expression jedes Klasse-I-Proteins wird bei bestimmten Schwellenwerten der Shh-Aktivität ausgelöscht; umgekehrt hängt die Expression der Klasse-II-Proteine von der Shh-Signalisierung ab. In vivo unterteilen die Expressionsmuster dieser Gene das ventrale Neuralrohr in scharf abgegrenzte Bereiche, die an die bei Drosophila beobachteten Bereiche erinnern, wobei die ventrale Grenze der meisten Klasse-I-Proteine der dorsalen Grenze der Expression eines Klasse-II-Proteins entspricht. Dies wird durch selektive kreuzrepressive Wechselwirkungen zwischen den komplementären Paaren von Klasse-I- und Klasse-II-Proteinen erreicht, die in benachbarten, aneinanderstoßenden Domänen exprimiert werden (Briscoe et al., 2001; Briscoe et al., 2000). Sowohl im Wirbeltier- als auch im Drosophila-Nervensystem (Cowden und Levine, 2003) legen die repressiven Interaktionen Schwellenwerte für die Genantwort fest und erzeugen die scharfen Grenzen der Genexpression, die sicherstellen, dass jede Vorläuferdomäne einen bestimmten Satz von Transkriptionsfaktoren exprimiert. Dieser Mechanismus wandelt einen Gradienten von Positionsinformationen in diskrete Alles-oder-Nichts-Änderungen in der Genexpression um.

Das Prinzip der kreuzregulatorischen Interaktionen wird auch in anderen sich entwickelnden Geweben beobachtet, was darauf hindeutet, dass es eine allgemeine Strategie zur Interpretation abgestufter Positionsinformationen darstellen könnte. Der Bcd-Gradient spezifiziert die Expressionsdomänen der Gap-Gene, die die für die Segmentierung des Embryos erforderlichen Gene für die Paarungsregel und die Segmentpolarität stromabwärts positionieren (Jäckle et al., 1986; Kraut und Levine, 1991). Sowohl asymmetrische als auch reziproke repressive Interaktionen zwischen Gap-Genen scheinen einen komplizierten Kreislauf zu bilden. Eine starke reziproke Repression zwischen Genpaaren gewährleistet die gegenseitige Exklusivität der Expression, während eine asymmetrische Repression anteriorer Gap-Gene durch posteriore Gene zu einer anterioren Verschiebung ihrer posterioren Grenzen führt (Jaeger et al., 2004; Monk, 2004) (Abb. 2E). Diese Ergebnisse heben ein dynamisches Merkmal der Interpretation des Bcd-Gradienten hervor, bei dem räumliche Bereiche der Genexpression durch nachfolgende asymmetrische repressive Interaktionen zwischen Gap-Genen neu positioniert werden können.

Reziproker Repressor-Gradient

Ein gemeinsames Merkmal vieler Morphogen-Gradienten ist die Etablierung eines inversen Gradienten eines transkriptionalen Repressors, der reziprok zu dem durch das Signal aktivierten transkriptionalen Effektor ist (Abb. 2A). Im Falle der Sh- und Wnt-Signalübertragung bewirken die primären Transkriptionseffektoren dieser Signalwege in Abwesenheit der Signalübertragung eine transkriptionelle Unterdrückung, werden aber bei Signalübertragung in Transkriptionsaktivatoren umgewandelt (Giles et al., 2003; Jacob und Briscoe, 2003). Die Wirkung der Signalisierung besteht also in der Bildung eines Gradienten von Transkriptionsaktivatoren mit einem entgegengesetzten Repressionsgradienten, eine Strategie, die die durch das Morphogen vermittelten Veränderungen der Transkriptionsaktivität verstärken könnte. Eine Variation dieser Strategie wird bei der Interpretation des Dpp-Gradienten in der Flügelimaginalscheibe von Drosophila verwendet. Hier scheint die Hauptrolle der Dpp-Signalisierung in der Schaffung eines reziproken Gradienten des Brinker (Brk)-Repressorproteins zu bestehen. Mad und Medea unterdrücken Brk direkt in einem Komplex mit dem Schnurri-Transkriptionsfaktor (Pyrowolakiset al., 2004), und die Empfindlichkeit gegenüber der Brk-Unterdrückung setzt die Grenzen für die Expression der Dpp-Schwellenreaktionen, einschließlich spalt (sal) und optomotor-blind (omb) (Muller et al., 2003).Die omb-Expression wird in mad-Mutantenklonen aufgrund der Derepression von Brk unterdrückt. In brk-mad-Doppelmutantenklonen kommt es jedoch zu einer ektopischen Aktivierung von omb, was darauf hindeutet, dass die einzige Voraussetzung für die Ombexpression die Unterdrückung von Brk durch Dpp-Signale ist. Im Gegensatz dazu erfordert die Expression maximaler Mengen von sal einen positiven Input durch die Smads (Affolter et al., 2001; Barrio und de Celis, 2004). In anderen Entwicklungskontexten wurde festgestellt, dass Mad und Brk um dieselben Bindungsstellen konkurrieren (Affolter et al., 2001), obwohl die Bedeutung dieses Umstandes für die Etablierung der Zielgenexpressionsdomänen der Flügel unklar ist.