Das Aufkommen der „Präzisionsmedizin“ ist durch viele neue Verbesserungen bei diagnostischen, prognostischen und therapeutischen Methoden und Verfahren gekennzeichnet. Im Rahmen dieser Initiative hat man sich darauf konzentriert, die Menge des für die Tests benötigten Gewebes durch weniger invasive und sicherere Verfahren zu minimieren. Eine Methode, die in den letzten Jahren auf großes Interesse gestoßen ist, ist die „Flüssigbiopsie“. Zwar gibt es unterschiedliche Definitionen für die genaue Bedeutung dieses Begriffs, aber im Großen und Ganzen kann man darunter die Entnahme einer Körperflüssigkeitsprobe verstehen, die auf relevante Biomarker untersucht wird, um Informationen über die Behandlung des Patienten zu erhalten. Am häufigsten wird er auf die Entnahme von peripherem Blut zur Analyse zellfrei zirkulierender Tumor-Desoxyribonukleinsäuren (DNA) angewandt.

Die erste Beschreibung zirkulierender, zellfreier DNA im menschlichen Blut stammt aus dem Jahr 1948, fand aber in der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft wenig Beachtung.2 Im Jahr 1977 stellten Wissenschaftler fest, dass im Plasma und Serum von Krebspatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpatienten ungewöhnlich hohe Mengen zellfreier DNA (cfDNA) vorhanden waren, und es wurde angenommen, dass es sich bei dieser cfDNA hauptsächlich um zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) handelte1,5. Seit dieser ursprünglichen Beschreibung haben andere Forschungsarbeiten ergeben, dass eine erhöhte cfDNA im Allgemeinen eine Vielzahl von pathologischen Prozessen widerspiegelt, einschließlich bösartiger und gutartiger neoplastischer Zustände, entzündlicher Erkrankungen, Schlaganfall, Trauma und Sepsis. Bei diesen Prozessen können Nukleinsäuren von apoptotischen und nekrotischen Zellen oder durch kontrollierte Sekretion von lebenden Zellen in das Blut abgegeben werden2,11. Während zellfreie DNA oft synonym mit zirkulierender Tumor-DNA verwendet wird, sollte man bedenken, dass auch zirkulierende Nicht-Tumor- und Nicht-Mensch-DNA in einer Probe vorhanden sein kann.

Während der derzeitige Schwerpunkt auf der DNA liegt, gehören zu den weiteren Bestandteilen einer Flüssigbiopsie Ribonukleinsäuren (RNA), zirkulierende Tumorzellen (CTCs), extrazelluläre Vesikel (EVs) und tumorausgebildete Plättchen (TEPs). Die letztgenannten Komponenten sind vor allem für die Forschung von Interesse. Mit zunehmender translationaler Forschung könnten diese zusätzlichen Bestandteile einer Flüssigbiopsie in Zukunft zunehmend klinische Anwendung finden. Eine Übersicht über diese Elemente würde den Rahmen dieses Artikels sprengen, und der Leser wird zur weiteren Lektüre auf den Artikel von Batth et al. verwiesen.

Technologische Überlegungen

Bis vor kurzem war die verfügbare Technologie nicht empfindlich genug, um ctDNA nachzuweisen und sinnvoll zu nutzen. Im Gegensatz zu molekularen Assays, die an Körperflüssigkeiten zum Nachweis von Nukleinsäuren von Viren und anderen Mikroorganismen durchgeführt werden, die von relativ großen Mengen an Nukleinsäuren profitieren, liegen zirkulierende Tumor-Nukleinsäurefragmente nur in einem Bruchteil der normalen Nicht-Tumor-cfDNA vor. ctDNA sind in der Regel kleine DNA-Fragmente im Bereich von 140-170 Basenpaaren (bp)3, und Tumortyp, Progression, Belastung, Proliferationsraten und Therapie wirken sich alle auf die Menge der ctDNA in einer Probe aus. Darüber hinaus ist ctDNA in Plasma und Serum zwar relativ stabil, wird aber innerhalb weniger Stunden durch Leber und Nieren aus dem Kreislauf entfernt 3,4. Nichtsdestotrotz haben Fortschritte bei den präanalytischen Prozessen und Reinigungsmethoden eine erfolgreiche Erfassung, Amplifikation und Sequenzierung von ctDNA ermöglicht.

Methoden, die derzeit zum Nachweis oder zur Messung von ctDNA verwendet werden, lassen sich grob in zwei Kategorien einteilen: auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende und auf der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) basierende. PCR-basierte Assays haben in der Regel eine schnellere Durchlaufzeit und sind kostengünstiger, können aber in der Regel nur eine oder einige wenige spezifische Mutationen gleichzeitig bewerten (begrenzte Multiplexing-Fähigkeit). PCR-basierte Ansätze können weiter unterteilt werden in Methoden, die für mutierte Sequenzen im Verhältnis zum Wildtyp (nicht mutiert) anreichern, und solche, die eine Quantifizierung durch Kompartimentierung erreichen. Ein Beispiel für die letztere Gruppe ist die „digitale PCR“, die immer häufiger zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer, bekannter Mutationen in ctDNA eingesetzt wird. Die PCR wird in Tausende von winzigen einzelnen Reaktionsvolumina aufgeteilt, entweder auf einem Chip oder durch die Herstellung von Wasser-in-Öl-Tröpfchen. Jedes Kompartiment oder Tröpfchen enthält entweder ein bestimmtes Template-Fragment oder nicht und erzeugt ein Fluoreszenzsignal, wenn ein entsprechendes Template-Fragment in diesem Volumen vorhanden ist. Durch Zählen der einzelnen fluoreszierenden Volumina lässt sich die Anzahl der spezifisch anvisierten Template-Moleküle in der Probe schätzen. Bei mehreren gleichzeitig getesteten Zielmolekülen (Multiplexing) können verschiedene Fluoreszenzsignale bestimmten Variationssequenzen zugeordnet werden.

Auf Sequenzierung basierende Ansätze der nächsten Generation ermöglichen die Bewertung eines viel breiteren Spektrums möglicher Mutationen, da bei der Sequenzierung Mutationen überall in den erfassten Regionen nachgewiesen werden können. Um mutationsanfällige Regionen des Genoms zu erfassen, können NGS-Bibliotheken aus Plasma-DNA entweder mit Ligations-/Hybrid-Capture-Methoden oder gezielten PCR-Anreicherungsmethoden hergestellt werden. Der Anteil der Allel-Varianten ist in Flüssigbiopsien in der Regel viel geringer als in Gewebebiopsien (oft <1 %), so dass die interessierenden Regionen tiefer sequenziert werden müssen als bei der NGS von primärem Tumorgewebe. Darüber hinaus sind umfangreiche Optimierungen der präanalytischen und analytischen Prozesse erforderlich, um die Input-Probe zu maximieren und PCR- und Sequenzierungsfehler zu reduzieren. NGS-Ansätze haben den großen Vorteil, dass sie eine viel breitere Mutationsabdeckung erreichen (gleichzeitige Analyse von Tausenden von möglichen Mutationen). Daher ist eine vorherige Kenntnis der spezifischen Mutationen des Tumors nicht erforderlich. Im Vergleich zu einfacheren PCR-basierten Methoden sind NGS-Techniken jedoch teurer, zeitaufwändiger und technisch anspruchsvoller.

Vor- und Nachteile

Die Vorteile von Flüssigbiopsien liegen vor allem darin, dass die Verfahren zu ihrer Gewinnung im Vergleich zu Standard-Tumorbiopsien wesentlich weniger invasiv sind. Betrachten Sie zum Beispiel das Verfahren zur Biopsie einer Lungenmasse. Liegt die Masse an einer Stelle, die für eine interventionelle Radiologie oder eine chirurgische Biopsie zugänglich ist, besteht das Risiko eines Pneumothorax oder einer Blutung, ungeachtet der Kosten für die Unterhaltung eines Operationssaals, in dem die Operation durchgeführt werden kann. Flüssigbiopsien ermöglichen auch häufigere und serielle Probenahmen im Laufe der Zeit, um das Verhalten von Tumoren und ihr Ansprechen auf die Therapie besser zu erfassen. So wiesen in einer Studie Darmkrebspatienten, die später röntgenologisch ein gutes Ansprechen auf die Behandlung zeigten, nach den ersten zwei Wochen der Behandlung einen Rückgang der ctDNA-Werte um >90% auf 9. Dies hat sich als Stratifizierung des Rezidivrisikos nach einer Resektion mit kurativer Absicht erwiesen. In einer anderen Studie hatten Brustkrebspatientinnen, bei denen nach der Resektion ctDNA nachweisbar war, ein 25-fach höheres Risiko für ein Wiederauftreten der Erkrankung 10. Diese Konzepte sind vergleichbar mit den Tests, die derzeit bei hämatologischen Malignomen durchgeführt werden, z. B. bei chronischer myeloischer Leukämie (CML) und seriellen Tests auf das Vorhandensein von BCR-ABL-Fusionstranskripten. Schließlich kann in Fällen, in denen keine Gewebebiopsie zur Verfügung steht, das molekulare Profiling von Tumoren mittels Flüssigbiopsie durchgeführt werden.

Zu den wichtigen Nachteilen der Flüssigbiopsie gehört, dass eine erste histologische Diagnose durch eine Gewebebiopsie gestellt werden muss. Laboratorien, die diese Tests durchführen, müssen auf eine angemessene Testnutzung und das Potenzial für eine „Überinterpretation“ im klinischen Kontext achten. Die geringe Variantenhäufigkeit im peripheren Blut kann zu höheren Falsch-negativ-Raten führen und erfordert einen deutlich höheren technischen Aufwand und mehr Fachwissen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.

Aktuelle und neue Anwendungen

Die klinische Nutzung der Flüssigbiopsie hat seit 2014, als die erste kommerziell verfügbare Multigen-Flüssigbiopsie-Plattform verfügbar wurde, deutlich zugenommen. Mehrere Assays sind im Handel erhältlich und von der FDA zugelassen, und einige werden von den Krankenkassen als ausreichend für eine Behandlung erachtet. So hat die FDA 2016 den cobas® EGFR-Mutationstest v2 zugelassen, um festzustellen, ob Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs für die Behandlung mit bestimmten EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren in Frage kommen. Die Flüssigbiopsie zum Ausschluss von Patienten von einer zielgerichteten Therapie hat sich in der klinischen Praxis viel langsamer durchgesetzt, vor allem aufgrund von Bedenken hinsichtlich falsch negativer Ergebnisse und allgemein zugänglichem Tumorgewebe 3. Die zunehmende klinische Nutzung wurde auch von Patienten und Ärzten vorangetrieben, die zielgerichtete Mutationen für den Off-Label-Einsatz oder die Teilnahme an klinischen Studien identifizieren wollten.

Zu den sich abzeichnenden Verwendungszwecken von Flüssigbiopsien gehören ihr Einsatz als Ergänzung zur Mutationsprofilerstellung in Gewebebiopsien, die Bewertung des Ansprechens auf die Behandlung, die Überwachung der Restkrankheit, die Erkennung des Wiederauftretens der Krankheit und die Überwachung des Auftretens von Resistenzmutationen 3.

Future Directions

Die zu erwartende Krebsspezifität der Mutationen macht die ctDNA zu einem attraktiven Biomarker für die Krebsfrüherkennung, was enorme Auswirkungen auf die Patientenversorgung haben könnte. Da Tumore im Frühstadium jedoch bekanntermaßen nur sehr wenig DNA freisetzen, sind noch viele technische Herausforderungen zu bewältigen. Obwohl die Flüssigbiopsie ein attraktives Instrument für die Krebsfrüherkennung bei asymptomatischen Patienten sein kann, müssen solche Anwendungen sorgfältig und wohl überlegt sein, um übermäßiges Leiden der Patienten und Kosten aufgrund falsch positiver Ergebnisse zu vermeiden. Kurzfristig könnten Flüssigbiopsien hilfreicher sein, um die Bösartigkeit von Patienten mit bereits klinisch oder röntgenologisch erkennbaren Läsionen zu bestätigen.

Schlussfolgerung

Die Literatur zum Thema ctDNA-Tests wächst schnell und entwickelt sich weiter. Zu den laufenden Untersuchungen gehören präanalytische Prozesse, Faktoren, die die ctDNA-Nachweisrate beeinflussen, und prospektive klinische Studien. Es ist wahrscheinlich, dass ctDNA in der klinischen Versorgung eine größere Rolle spielen wird, da die fortgesetzte Forschung zu CTCs, cfDNA/RNA und extrazellulären Vesikeln der Momentaufnahme des Tumorstatus, die durch Flüssigbiopsien gewonnen wird, eine höhere Auflösung verleihen wird.4