Abstract

Das Ziel dieser Studie war es, die Aktivität von Fluconazol gegen 32 klinische Stämme von Fluconazol-resistentem Candida albicans und C. albicans ATCC 10231 zu untersuchen, nachdem diese subletalen Konzentrationen von Teebaumöl (TTO) oder seinem bioaktiven Hauptbestandteil Terpinen-4-ol ausgesetzt waren. Bei allen getesteten fluconazolresistenten C. albicans-Stämmen waren die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von TTO und Terpinen-4-ol niedrig und lagen zwischen 0,06% und 0,5%. Die 24-stündige Exposition von Fluconazol-resistenten C. albicans-Stämmen gegenüber Fluconazol mit einer subletalen TTO-Dosis verstärkte die Fluconazol-Aktivität gegen diese Stämme. Insgesamt wurden 62,5 % der Isolate als empfindlich eingestuft, 25,0 % wiesen eine mittlere Empfindlichkeit auf, und 12,5 % waren resistent. Bei allen getesteten klinischen Stämmen sank die Fluconazol-MHK von durchschnittlich 244,0 μg/ml auf durchschnittlich 38,46 μg/ml, und die minimalen fungiziden Konzentrationen (MFC) von Fluconazol sanken von durchschnittlich 254,67 μg/ml auf durchschnittlich 66,62 μg/ml. Terpinen-4-ol erwies sich als aktiver als TTO und verstärkte die Fluconazol-Aktivität gegenüber Fluconazol-resistenten C. albicans-Stämmen erheblich. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Kombination von natürlichen Substanzen wie TTO und konventionellen Medikamenten wie Fluconazol bei der Behandlung schwieriger Hefeinfektionen helfen kann.

1. Einleitung

Ätherische Öle sind antiseptische Substanzen, die von Pflanzen produziert werden. Teebaumöl (TTO) ist das durch Wasserdampfdestillation aus der in Australien heimischen Pflanze Melaleuca alternifolia gewonnene ätherische Öl, das in der Medizin als topisches Antiseptikum verwendet wird. Es hat ein breites Spektrum an antimikrobieller Aktivität gegen eine Vielzahl von Bakterien, Viren und Pilzen, einschließlich Hefen und Dermatophyten. TTO ist ein Gemisch aus mehr als 100 verschiedenen Verbindungen, vor allem Terpenen (hauptsächlich Monoterpenen und Sesquiterpenen). Die physikalischen Eigenschaften und die chemische Zusammensetzung von TTO sind unterschiedlich, weshalb es wichtig ist, internationale Normen festzulegen. Die australische Norm für Teebaumöl (AS 2782-1985) enthält Richtlinien für den Gehalt an zwei Bestandteilen: Der Mindestgehalt an Terpinen-4-ol muss mindestens 30 % und der Höchstgehalt an 1,8-Cineol muss weniger als 15 % des Ölvolumens betragen. Die internationale Norm für Teebaumöl (ISO 4730:2004) enthält Höchst- und Mindestprozentwerte für die 15 wichtigsten TTO-Bestandteile. TTO, das durch Wasserdampfdestillation der Blätter und Endzweige von Melaleuca alternifolia Cheel, Melaleuca linariifolia Smith, Melaleuca dissitiflora F. Mueller und anderen Melaleuca-Arten gewonnen wird, sollte dieser Norm entsprechen.

TTO wird seit Jahrhunderten in der australischen Volksmedizin verwendet, vorwiegend zur Wundbehandlung . In den 1920er Jahren beschrieb Penfold zum ersten Mal die Eigenschaften und die chemische Zusammensetzung von TTO und bestätigte später die antiseptischen Eigenschaften von TTO und seinen Bestandteilen. In den 1930er Jahren erschienen mehrere Veröffentlichungen, die die starke antimikrobielle Wirkung von TTO bei der Inhalationstherapie, der aseptischen Chirurgie, der zahnärztlichen Chirurgie, der Wunddesinfektion und der Mundhöhlenspülung nachwiesen.

Heute wird TTO als lokales Mittel zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt, vor allem bei Dermatosen (z. B. rezidivierender Herpes labialis, Akne, Pusteln, Schuppen und Hautausschlag). TTO wird auch zur Behandlung von Staphylococcus aureus-Infektionen der Mundhöhle und des Rachens, Vaginitis und Atemwegserkrankungen eingesetzt. Zahlreiche Studien haben die breite antimikrobielle Wirkung von TTO gegen Bakterien, Pilze und Viren sowie gegen Mikroorganismen, die gegen herkömmliche Arzneimittel resistent sind, bestätigt. Dies ist angesichts der Zunahme schwer zu behandelnder Infektionen wichtig, da TTO als Alternative zu oder in Kombination mit herkömmlichen Arzneimitteln (einschließlich Antibiotika und Chemotherapeutika) eingesetzt werden kann.

Die Behandlung von Infektionen kann auf einer Monotherapie (mit einem antimikrobiellen Arzneimittel) oder einer Kombinationstherapie (mit zwei oder mehr Arzneimitteln) basieren. Das Hauptziel der Kombinationstherapie besteht darin, durch Synergieeffekte die Wirkung der Medikamente zu verstärken und gleichzeitig die Dosierung zu verringern. Wenn eine Mono- oder Kombinationstherapie mit herkömmlichen Arzneimitteln erfolglos ist, kann eine kombinierte Behandlung mit einem natürlichen Wirkstoff wirksamer sein. Mehrere neuere Studien haben über die erhöhte antimikrobielle Aktivität von Naturstoffen in Kombination mit konventionellen Arzneimitteln im Vergleich zur alleinigen Behandlung mit konventionellen Arzneimitteln berichtet.

Ziel dieser Studie war es, die Aktivität von Fluconazol gegen klinische Stämme von Fluconazol-resistentem Candida albicans und den Referenzstamm C. albicans ATCC 10231 zu bewerten, nachdem sie subletalen Konzentrationen von TTO oder seinem bioaktiven Hauptbestandteil Terpinen-4-ol ausgesetzt waren.

2. Materialien und Methoden

2.1. Candida albicans-Stämme

Diese Studie umfasste 32 klinische Candida albicans-Stämme, die aus den folgenden Materialien isoliert wurden: Abstriche des Rachens und der Mundhöhle (), der Vagina (), Sputum () oder Fäkalien (). Diese Stämme wurden aus Kulturen auf Sabouraud-Agar (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) isoliert, und die Speziesidentifizierung erfolgte mit dem biochemischen Test ID 32C (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Frankreich). Wir verwendeten auch den Referenzstamm C. albicans ATCC 10231, der von Oxoid Ltd. (Basingstoke, Großbritannien) erworben wurde. Zuvor hatten wir die Empfindlichkeit der C. albicans-Stämme gegenüber Fluconazol mit dem Kirby-Bauer-Scheibendiffusionstest bestimmt, bei dem 6-mm-Filterpapierscheiben verwendet wurden, die mit 10 μg Fluconazol imprägniert waren, das von DHN (Krakau, Polen) und YNB-Agar (Yeast Nitrogen Base-Difco 0,5 %, Glucose 3 %, Agar 1,8 %, pH = 7), ebenfalls von DHN (Krakau, Polen), bezogen wurde. Die C. albicans-Stämme wurden als empfindlich (Durchmesser der Wachstumshemmungszone ≥18 mm), intermediär empfindlich (Durchmesser der Wachstumshemmungszone von 14 mm bis 17 mm) oder resistent (Durchmesser der Wachstumshemmungszone <14 mm) gegenüber Fluconazol eingestuft (die Daten wurden in Kapitel 3 beschrieben). Die MHK- (minimale Hemmkonzentration) und MFC-Werte (minimale fungizide Konzentration) von Fluconazol wurden nach der Brüheverdünnungsmethode gemäß dem Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI-Dokument M27-A3-2008) bestimmt. Anhand dieses Standards wurden die C. albicans-Stämme als empfindlich (MHK ≤ 8 μg/mL), mittelmäßig empfindlich (MHK von 9 μg/mL bis 63 μg/mL) oder resistent (MHK ≥ 64 μg/mL) gegenüber Fluconazol eingestuft (die Daten wurden in Kapitel 3 vorgestellt).

2.2. Teebaumöl (TTO)

In dieser Studie verwendeten wir australisches Teebaumöl (Melaleuca alternifolia) von Thursday Plantation (Integria Healthcare, Eight Mile Plains, QLD, Australien) der Serie 270930, das der ISO-Norm 4730:2004 entspricht (Tabelle 1). TTO wurde aus speziell ausgewählten Blättern von Melaleuca alternifolia destilliert, einer Pflanze, die in den Küstenregionen des nördlichen New South Wales und des südöstlichen Queensland in Australien heimisch ist. Die Analyse der TTO-Zusammensetzung erfolgte mittels Gaschromatographie gemäß der internationalen Norm ISO 4730. Sie wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Quarzglas-Säule (50 m × 0,20 mm i.d., Schichtdicke 0,25 μm) und ein Flammenionisationsdetektor wurden verwendet, das Trägergas war Wasserstoff (Durchflussrate 1 mL/min), das Ofentemperaturprogramm reichte von 70°C bis 220°C bei einer Rate von 2°C/min, die Injektortemperatur betrug 230°C, die Detektortemperatur 250°C, das Volumen des injizierten TTO betrug 0,2 μL, und das Split-Verhältnis betrug 1 : 100.

In unserer Studie verwendeten wir auch Terpinen-4-ol, das von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen wurde.

2.3. Fluconazol

In dieser Studie wurde das Antimykotikum Fluconazol (Polfarmex, Kutno, Polen) verwendet. Die Struktur des Fluconazol-Moleküls ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1

Chemische Struktur von Fluconazol.

2.4. Herstellung der anfänglichen Candida albicans-Suspension

C. albicans-Zellen, die 24 Stunden lang auf Sabouraud-Agar kultiviert worden waren, wurden in einer Kochsalzlösung (0,85% NaCl) suspendiert und auf einen 0,5 McFarland-Dichte-Standard (1,5 × 108 KBE/ml) eingestellt. Diese Suspension wurde später auf eine Dichte von 6 × 104 KBE/ml verdünnt. Die Suspension wurde dann zur Schätzung der MHK- und MFC-Werte für TTO, Terpinen-4-ol und Fluconazol verwendet.

2.5. Bestimmung der MHK- und MFC-Werte für TTO und Terpinen-4-ol

Die Aktivität von TTO gegen die getesteten C.-albicans-Stämme wurde durch Brühenmakrodilution unter Verwendung der allgemeinen Verdünnungsstandards gemäß PN-EN ISO 20776-1:2007 bestimmt. TTO wurde seriell in flüssigem Sabouraud-Medium mit 10 % Tween 80 auf TTO-Endkonzentrationen von 1 % bis 0,0075 % verdünnt. Das Detergens Tween 80 trägt zur Auflösung des TTO bei. Jedem Röhrchen wurde das gleiche Volumen der C. albicans-Suspension zugesetzt, um eine Enddichte von 3 × 103 KBE/ml zu erreichen. Nach 24 Stunden Inkubation bei 35 °C wurde das Zellwachstum in den Röhrchen mit TTO und dem Röhrchen der Positivkontrolle (ohne TTO) visuell bewertet. Die MHK wurde als die niedrigste Konzentration von TTO definiert, die zu keinem sichtbaren Wachstum der getesteten Zellstämme führte. Der MFC-Wert wurde als die niedrigste Konzentration von TTO definiert, die kein Wachstum von C. albicans-Kolonien zeigte. Der Versuch wurde dreifach durchgeführt. Die MHK- und MFC-Werte von Terpinen-4-ol wurden auf die gleiche Weise bestimmt wie oben beschrieben. Die MHKs von TTO und Terpinen-4-ol wurden zur Berechnung der subletalen Dosen von TTO und Terpinen-4-ol verwendet, die in den folgenden Experimenten eingesetzt wurden.

2.6. Kurze Vorbehandlung von Candida albicans mit 1/4 MHK TTO

Für jede Probe wurde ein Röhrchen mit Kochsalzlösung mit 10 % Tween 80 und TTO bis zu einer Endkonzentration von 1/4 MHK TTO vorbereitet. Ein Kontrollröhrchen ohne TTO wurde ebenfalls vorbereitet. Anschließend wurde die C. albicans-Suspension in die Röhrchen gegeben, um eine Enddichte von 3 × 103 KBE/ml zu erreichen. Die Suspensionen wurden dann 30 Minuten lang bei 35 °C bebrütet. Die Proben wurden dann zweimal gespült und zwischen den Spülungen zentrifugiert (3000 ×g, 15 Minuten), und die Zellen wurden bis zu einer Dichte von 6 × 104 KBE/ml resuspendiert. Die Suspension wurde dann zur Bestimmung der Fluconazol-MHK und der minimalen fungiziden Konzentration (MFC) von Fluconazol verwendet. Die Studie wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt.

2.7. Bestimmung der Fluconazol-MHK- und MFC-Werte nach kurzer Vorbehandlung von Candida albicans mit 1/4 MIC TTO

Die Fluconazol-Aktivität gegen die getesteten C. albicans-Stämme wurde durch Brühe-Makrodilution unter Verwendung der allgemeinen Verdünnungsstandards, wie in PN-EN ISO 20776-1:2007 beschrieben, bestimmt. Es wurden serielle, parallele Verdünnungen von Fluconazol im Bereich von 256,0 μg/mL bis 0,125 μg/mL in flüssigem Sabouraud-Medium hergestellt, und ein Kontrollröhrchen ohne das Arzneimittel wurde beigefügt. In jedes der Röhrchen wurde das gleiche Volumen einer mit 1/4 MHK TTO vorbehandelten C. albicans-Zellsuspension gegeben, und das Inokulum wurde auf eine Enddichte von 3 × 103 KBE/ml eingestellt. Nach 24 Stunden Inkubation bei 35 °C wurde das Zellwachstum in jedem Röhrchen visuell bewertet. Der MHK-Wert wurde als die niedrigste Fluconazol-Konzentration definiert, die zu keinem sichtbaren Wachstum der getesteten Stämme führte. Die Zellen aus dem Röhrchen, das als MHK identifiziert wurde, sowie mehrere der umliegenden Verdünnungen wurden auf Sabouraud-Agar ausplattiert. Nach 24 Stunden Bebrütung bei 35 °C wurden die C. albicans-Kolonien gezählt. Der MFC-Wert wurde als die niedrigste Fluconazol-Konzentration definiert, bei der kein Wachstum von C. albicans-Kolonien zu verzeichnen war. Der Versuch wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die C.-albicans-Stämme wurden gemäß CLSI-Dokument M27-A3-2008 als empfindlich, intermediär empfindlich oder resistent gegenüber Fluconazol eingestuft, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.

2.8. Längere Vorbehandlung von Candida albicans mit Fluconazol und subletaler Dosis von TTO oder Terpinen-4-ol

Serielle, parallele Verdünnungen von Fluconazol im Bereich von 256,0 μg/mL bis 0,125 μg/mL wurden in flüssigem Sabouraud-Nährmedium hergestellt. Es wurden zwei Positivkontrollen einbezogen. Alle Röhrchen enthielten 10 % Tween 80, und jeder Verdünnung sowie einem der Kontrollröhrchen wurde TTO zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1/4 MHK TTO zu erreichen. Das zweite Kontrollröhrchen enthielt nur das flüssige Medium. Anschließend wurde jedem Röhrchen ein gleiches Volumen an C. albicans-Suspension bis zu einer Enddichte von 3 × 103 KBE/ml zugesetzt. Alle Röhrchen wurden 24 Stunden lang bei 35 °C bebrütet. Nach der Bebrütung wurde das Zellwachstum in jedem Röhrchen visuell ausgewertet, und die Fluconazol-MHK- und MFC-Werte wurden wie zuvor beschrieben bestimmt. Die Zellen aus dem Röhrchen, das als MHK identifiziert wurde, sowie mehrere der umliegenden Verdünnungen wurden auf Sabouraud-Agar ausplattiert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 35 °C wurden die C. albicans-Kolonien gezählt und der Fluconazol-MHK-Wert bestimmt. Der Versuch wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die verlängerte Vorbehandlung von C. albicans mit Fluconazol und Terpinen-4-ol wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben durchgeführt.

2.9. Statistische Methoden

Die Ergebnisse werden als arithmetisches Mittel und als Median angegeben. Die statistischen Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit dem Student-Test und dem Mann-Whitney-Test ermittelt, je nachdem, wie gut die Ergebnisse mit einer Normalverteilung übereinstimmten. Werte von wurden als statistisch signifikant angesehen. Zur Durchführung der statistischen Analysen wurde das Programm STATISTICA Version 10 (StatSoft, Krakau, Polen) verwendet.

3. Ergebnisse

Die getesteten Candida albicans-Stämme waren resistent gegen Fluconazol und empfindlich gegenüber niedrigen Konzentrationen von TTO. Die klinischen C. albicans-Stämme und der Referenzstamm C. albicans ATCC 10231, die mit dem Kirby-Bauer-Scheibendiffusionstest getestet wurden, wiesen keine Wachstumshemmungszone auf. Alle untersuchten C. albicans-Stämme wurden als resistent gegenüber Fluconazol eingestuft. Die Fluconazol-MHK-Werte für die 32 klinischen C. albicans-Stämme reichten von 64,0 μg/ml bis 256,0 μg/ml (Durchschnitt = 244,0 ± 47,22 μg/ml). Die häufigsten Werte waren 256,0 μg/mL (30 Stämme) und 64,0 μg/mL (2 Stämme). Beim Referenzstamm C. albicans ATCC 10231 lag die Fluconazol-MHK bei 256,0 μg/mL.

Die TTO-MHKs für die 32 klinischen C. albicans-Stämme reichten von 0,06 % bis 0,5 % (Durchschnitt = 0,19 ± 0,09 %). Die häufigsten Werte waren 0,125 % (15 Stämme) und 0,25 % (15 Stämme). Die TTO-MHKs der beiden übrigen Stämme lagen bei 0,06 % und 0,5 %. Beim Referenzstamm C. albicans ATCC 10231 lag die TTO-MHK bei 0,125 %. Diese Ergebnisse zeigen, dass die getesteten C. albicans-Stämme keine Kreuzresistenz gegenüber TTO und Fluconazol aufwiesen. Die TTO-MHK-Werte wurden zur Berechnung der subletalen Dosen (1/4 MHK TTO) verwendet, die im Rest der Studie eingesetzt wurden.

Die kurze Vorbehandlung von 32 klinischen C. albicans-Stämmen und dem C. albicans ATCC 10231 Referenzstamm mit 1/4 MHK TTO veränderte die Fluconazol-MHK- und MFC-Werte nicht. Wurden C. albicans-Stämme 24 Stunden lang mit 1/4 MHK TTO und Fluconazol behandelt (verlängerte Vorbehandlung), erhöhte sich die Empfindlichkeit der Hefestämme gegenüber Fluconazol signifikant. Von 32 fluconazolresistenten klinischen C. albicans-Stämmen wiesen 28 Stämme (87,5 %) eine hohe oder mittlere Anfälligkeit für Fluconazol auf (Tabelle 2).

Die 24-stündige Exposition von fluconazolresistenten C. albicans-Stämmen gegenüber 1/4 MIC TTO und Fluconazol verstärkte die Fluconazol-Aktivität gegen diese Stämme. Insgesamt wurden 62,5 % der Isolate als empfindlich eingestuft, 25,0 % wiesen eine mittlere Empfindlichkeit auf, und 12,5 % waren resistent. Bei allen getesteten klinischen Stämmen sank die durchschnittliche Fluconazol-MHK nach dieser verlängerten Vorbehandlung von 244,0 μg/ml auf 38,46 μg/ml, und die durchschnittliche Fluconazol-MFC sank von 254,67 μg/ml auf 66,62 μg/ml (Tabelle 3). Die MHK- und MFC-Werte für die anfälligen Stämme () und die Stämme mit mittlerer Anfälligkeit () waren statistisch gesehen niedrig im Vergleich zu den entsprechenden Werten, die für die Kontrollprobe und für die nur kurz mit TTO vorbehandelten Proben ermittelt wurden. Bei der Gruppe der anfälligen Isolate sank die Fluconazol-MHK auf durchschnittlich 0,52 μg/ml und die Fluconazol-MFC auf durchschnittlich 4,25 μg/ml. Eine längere Vorbehandlung des Standardstammes von Candida albicans ATCC 10231 mit 1/4 MHK TTO und Fluconazol erhöhte die Empfindlichkeit dieses Stammes gegenüber Fluconazol nicht, ebenso wie die vier untersuchten fluconazolresistenten klinischen C. albicans-Stämme.

Terpinen-4-ol, die wichtigste bioaktive Komponente in TTO, verstärkte die Fluconazol-Aktivität gegenüber Fluconazol-resistenten C. albicans-Stämmen stark. Die MHKs von Terpinen-4-ol für klinische C. albicans-Stämme reichten von 0,06 % bis 0,25 % (Durchschnitt = 0,11 ± 0,09 %). Für den Standardstamm C. albicans ATCC 10231 lag die MHK von Terpinen-4-ol bei 0,06 %. Die getesteten C. albicans-Stämme wiesen keine Kreuzresistenz gegenüber Terpinen-4-ol und Fluconazol auf. Wurden fluconazolresistente klinische und Standard-C.-albicans-Stämme 24 Stunden lang Fluconazol und subletalen Dosen (1/4 MHK) von Terpinen-4-ol ausgesetzt, verstärkte sich die Fluconazol-Aktivität gegen diese Stämme stark, und alle C.-albicans-Isolate wurden als empfindlich eingestuft (die Fluconazol-MHK sank auf 0,125 μg/ml). Wir fassten die Ergebnisse dieser Studie zusammen, und die wichtigsten Daten sind in Tabellenform dargestellt (Tabelle 4).

4. Diskussion

TTO ist das am häufigsten verwendete ätherische Öl aufgrund seiner antibakteriellen und antimykotischen Eigenschaften. In dieser Studie wurde die Veränderung der Fluconazol-Aktivität in vitro gegenüber Fluconazol-resistenten klinischen Candida albicans-Stämmen untersucht, die subletalen Konzentrationen von TTO oder Terpinen-4-ol, dem bioaktiven Hauptbestandteil von TTO, ausgesetzt waren. Frühere In-vitro-Studien zur Empfindlichkeit von Candida spp. gegenüber TTO haben gezeigt, dass TTO gegenüber diesen Mikroben sowie gegenüber Azol-resistenten Stämmen, für die die TTO-MHKs zwischen 0,25 % und 0,5 % lagen, sehr aktiv ist. Bei den C. albicans-Stämmen, die sowohl gegen Fluconazol als auch gegen Itraconazol resistent waren, lagen die TTO-MHKs zwischen 0,25 und 1,0 %, die TTO-MIC50 bei 0,5 % und die TTO-MIC90 bei 1 %. Eine andere Studie zeigte, dass drei Fluconazol-resistente klinische C. albicans-Stämme sehr niedrige TTO-MHKs aufwiesen (0,15 % für zwei Stämme und 0,07 % für den dritten Stamm).

Die in dieser Studie durchgeführten Experimente bestätigen die Ergebnisse früher veröffentlichter Studien insofern, als alle getesteten Fluconazol-resistenten C. albicans-Stämme empfindlich gegenüber TTO waren. Die ermittelten TTO-MHKs waren niedrig und lagen zwischen 0,06 % und 0,5 %. Die antimikrobielle Aktivität von TTO wird hauptsächlich auf Terpinen-4-ol, den wichtigsten bioaktiven Bestandteil von TTO, zurückgeführt. Die ermittelten MHK-Werte für Terpinen-4-ol waren sehr niedrig und reichten von 0,06 % bis 0,25 %. Unsere Studie und andere Studien zeigen, dass C. albicans keine Kreuzresistenz gegenüber TTO und Azolwirkstoffen aufweist. Eine klinische Resistenz gegen TTO ist nicht bekannt. Die Multikomponentennatur von TTO kann das Potenzial für eine spontane Resistenzbildung verringern, und es können mehrere gleichzeitige Mutationen erforderlich sein, um alle antimikrobiellen Wirkungen der einzelnen Komponenten zu überwinden. Somit kann TTO als topisches Antiseptikum zur wirksamen Behandlung oberflächlicher Mykosen eingesetzt werden, die durch Fluconazol-resistente Candida spp. und andere Azol-resistente Hefen verursacht werden. Leider kann TTO bei Einnahme hoher Dosen potenziell toxisch sein und sollte daher nicht oral verabreicht werden. Die akute orale Toxizität von TTO ist vergleichbar mit der oralen Toxizität anderer üblicher ätherischer Öle, wie z. B. Eukalyptusöl. Die lipophile Natur von TTO, die es ihm ermöglicht, die äußeren Hautschichten zu durchdringen, verstärkt nicht nur die antiseptische Wirkung, sondern auch die Möglichkeit einer TTO-Toxizität aufgrund der dermalen Absorption. TTO kann bei höheren Konzentrationen Hautreizungen verursachen und bei prädisponierten Personen allergische Reaktionen hervorrufen. Zhang und Robertson beobachteten eine ototoxische Wirkung von 100 % TTO. Die Toxizität von TTO ist dosisabhängig, und die meisten unerwünschten Wirkungen können durch die Verwendung von TTO in verdünnter Form vermieden werden. TTO ist weder mutagen noch genotoxisch.

Es besteht ein zunehmendes Interesse nicht nur an der Aktivität von Naturstoffen gegen resistente Mikroben, sondern auch an den synergistischen Wechselwirkungen zwischen diesen Stoffen und herkömmlichen Arzneimitteln. Fluconazol ist eines der Azol-Antimykotika, die sowohl zur Prophylaxe als auch zur Therapie von Candida-Infektionen eingesetzt werden. In dieser Studie untersuchten wir die Veränderungen in der Aktivität von Fluconazol gegen Fluconazol-resistente C. albicans-Stämme nach Exposition gegenüber subletalen Konzentrationen von TTO oder Terpinen-4-ol. Wir verwendeten ausschließlich fluconazolresistente Stämme, da die Identifizierung synergistischer Behandlungen für diese Stämme besonders wichtig wäre. Wir testeten subletale Konzentrationen von TTO und Terpinen-4-ol, da wir davon ausgingen, dass Konzentrationen unterhalb der MHK die Zellstruktur schwächen, ohne die Zellen abzutöten, wodurch die Aktivität von Fluconazol gefördert und folglich die Resistenz von C. albicans gegen Fluconazol gehemmt wird. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine kurze (0,5 h) Exposition von Fluconazol-resistenten C. albicans-Stämmen gegenüber einer subletalen Konzentration von TTO (1/4 MHK TTO) keinen Einfluss auf die antimykotische Aktivität von Fluconazol hat. Wurden die C. albicans-Zellen jedoch einer subletalen Konzentration von TTO ausgesetzt und anschließend mit Fluconazol behandelt, so wurde die Resistenz gegen Fluconazol bei 87,5 % der getesteten Stämme gehemmt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine synergistische Wechselwirkung zwischen Fluconazol und TTO gegen fluconazolresistente C. albicans gibt. TTO wurde verwendet, um die Hefezellmembranen zu permeabilisieren, was die Anfälligkeit für Fluconazol deutlich erhöht. Das TTO wird in die Lipid-Doppelschichtmembran eingebettet, wodurch deren Struktur gestört wird, was zu einer erhöhten Permeabilität und einer beeinträchtigten physiologischen Funktion führt. TTO hemmt auch die Bildung von Keimschläuchen oder die Myzelumwandlung bei C. albicans und hemmt die Atmung von C. albicans in dosisabhängiger Weise. Pilzzellen, die TTO ausgesetzt sind, brechen schließlich auf. Subletale Konzentrationen von TTO schwächen auch die Vitalität der Zellen von Candida spp. Der Mechanismus der antimykotischen Aktivität von Fluconazol ist anders. Es wurde nachgewiesen, dass Fluconazol das Cytochrom P-450-abhängige Enzym C-14α-Demethylase stört, das für die Produktion von Ergosterol verantwortlich ist. Die Unterbrechung der Ergosterin-Synthese führt zu strukturellen und funktionellen Veränderungen in der Pilzzellmembran, die die Pilzzellen für Schäden anfällig machen. Die Hemmung der oxidativen und peroxidativen Cytochrom-Enzyme ist eine weitere antimykotische Aktivität von Fluconazol. Für die Fluconazol-Resistenz von C. albicans-Isolaten wurden mehrere Mechanismen beschrieben: eine erhöhte Produktion der Lanosterol-14α-Demethylase, die vom ERG11-Gen kodiert wird, und eine Abnahme der Affinität der Lanosterol-14α-Demethylase für Fluconazol aufgrund von Mutationen im ERG11-Gen sowie ein Defekt der Δ5-6-Desaturase, die vom ERG3-Gen kodiert wird, was zu einem Funktionsverlust im Ergosterol-Weg führt. Der andere Mechanismus der Fluconazol-Resistenz bei C. albicans ist der aktive Transport von Arzneimitteln durch die Plasmamembran mittels „Efflux-Pumpen“, der die Expression der CDR1/2- und MDR1-Gene erfordert. TTO-induzierte Zellmembranschäden können die Funktion der „Efflux-Pumpen“ stören, wodurch die Pilzzelle anfälliger für Fluconazol wird.

Unsere Daten zeigen, dass es in vitro einen synergistischen Effekt von subletalen Konzentrationen von TTO und Fluconazol gegen Fluconazol-resistente C. albicans-Stämme gibt. Der Fluconazol-resistente C. albicans ATCC 10231-Standardstamm und vier klinische C. albicans-Stämme erhöhten jedoch nicht die Anfälligkeit für Fluconazol. Die Unterschiede in den Mechanismen der Resistenz dieser Stämme gegenüber Fluconazol waren wahrscheinlich die Ursache für diesen Effekt. In unserer In-vitro-Studie war der TTO-Hauptbestandteil Terpinen-4-ol aktiver als TTO und verstärkte die Fluconazol-Aktivität gegen alle untersuchten Fluconazol-resistenten C. albicans-Stämme stark. Mondello et al. sowie Ninomiya et al. stellten fest, dass TTO und Terpinen-4-ol in vivo ähnlich wirksam gegen die durch Azol-resistente C. albicans verursachte Candidose waren. Die Mechanismen, die der Synergie zwischen Fluconazol und TTO zugrunde liegen, wurden nicht aufgeklärt. Yu et al. bestätigten den Synergismus zwischen Fluconazol und Triclosan gegen klinische Isolate von Fluconazol-resistentem C. albicans. Liu et al. beobachteten einen synergistischen Effekt zwischen Fluconazol und Glabridin gegen C. albicans, der auf die Wirkung von Glabridin auf die Zellhülle zurückzuführen ist. Ahmad et al. beschrieben eine synergistische Wirkung von Thymol und Carvacrol mit Fluconazol gegen Candida-Isolate. Beide Monoterpene hemmten den Efflux um 70-90%, was ihre hohe Wirksamkeit bei der Blockierung von Medikamententransportpumpen belegt.

In früheren Studien wurde auch die Aktivität von TTO gegen verschiedene Mikroorganismen in Kombination mit anderen antimikrobiellen Substanzen untersucht. Ein synergistischer Effekt wurde für Itraconazol und TTO in einem thermosensitiven Gel zur Behandlung der vaginalen Candidiasis beobachtet. Synergistische Effekte wurden auch zwischen ätherischen Ölen und Ciprofloxacin, Gentamicin, Cefixim und Pristinamycin beobachtet. In einem Scheibendiffusionstest mit C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii und C. parapsilosis traten um mit TTO und Amphotericin B imprägnierte Scheiben größere Wachstumshemmungszonen auf als um Scheiben, die nur TTO enthielten. In einer Studie mit Staphylococcus aureus traten um Scheiben, die mit TTO und anderen ätherischen Ölen imprägniert waren, größere Wachstumshemmungszonen auf als um Scheiben, die nur mit TTO imprägniert waren.

Die synergistische Wirkung antimikrobieller Substanzen wurde auch anhand von Time-kill-Kurven nachgewiesen. Die kurze Vorbehandlung von Pseudomonas aeruginosa mit einer Substanz, die die Zytoplasmamembran zerstört (Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon, Polymyxin B-Nonapeptid oder Ethylendiamintetraessigsäure), verstärkte die bakterizide Aktivität von TTO, wie die erhöhte Geschwindigkeit der Mikrobenabtötung in den Time-kill-Kurven zeigt. In einer Studie unter Verwendung der E-Test-Methode wiesen Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus und koagulasenegative Staphylokokken (CoNS), die 72 Stunden lang subletalen Konzentrationen von TTO ausgesetzt waren, jedoch eine erhöhte Resistenz gegenüber Gentamicin auf, Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Erythromycin, Trimethoprim, Ampicillin, Fusidinsäure, Mupirocin, Linezolid und Vancomycin. Eine erhöhte antimikrobielle Aktivität wurde beobachtet, wenn ätherische Öle mit ihren isolierten Bestandteilen (z. B. Terpinen-4-ol aus Melaleuca alternifolia) kombiniert wurden und wenn TTO mit Silberionen kombiniert wurde.

Der Index der fraktionierten Hemmkonzentration (FIC), auch als FICI bezeichnet, wird verwendet, um festzustellen, ob zwei Substanzen synergistisch oder antagonistisch sind. FIC-Werte können unterschiedlich interpretiert werden, aber im Allgemeinen deutet ein FIC-Index von weniger als 0,5 auf Synergismus und ein FIC-Index von mehr als 4 auf Antagonismus hin. Der FIC-Index für TTO und Tobramycin betrug 0,37 für Escherichia coli und 0,62 für Staphylococcus aureus, was darauf hindeutet, dass diese beiden Substanzen synergistisch sind. Ein geringer synergistischer Effekt wurde bei der Behandlung von Candida albicans mit TTO und Amphotericin B und von Klebsiella pneumoniae mit TTO und Ciprofloxacin beobachtet. TTO und Ciprofloxacin zeigen antagonistische Wirkungen gegen Staphylococcus aureus. Es gibt keinen synergistischen Effekt zwischen TTO und Lysostaphin, Mupirocin, Gentamicin oder Vancomycin gegen Methicillin-resistente Staphylococcus-aureus-Stämme. Der FIC-Index wies sogar darauf hin, dass TTO und Vancomycin antagonistisch sind.

Die Ergebnisse dieser und anderer früherer Studien zeigen, dass die Kombination von Naturstoffen wie TTO und herkömmlichen Arzneimitteln wie Fluconazol zur Behandlung schwieriger Hefeinfektionen beitragen kann. Es sind jedoch weitere In-vitro-Studien erforderlich, um die antimikrobielle Aktivität natürlicher Arzneistoffe zu ermitteln und synergistische Wechselwirkungen mit üblicherweise verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffen festzustellen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Danksagungen

Die Autoren danken der Firma MELALEUCA in Gliwice (Polen) für die freundliche Spende des australischen Teebaumöls, das aus Melaleuca alternifolia gewonnen wird, der Firma Polfarmex in Kutno (Polen) für die freundliche Spende von Fluconazol und dem mikrobiologischen Labor LABOMED in Gliwice (Polen) für die freundliche Bereitstellung der klinischen Candida albicans-Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden.