Quellengenom-Zusammensetzung und Annotation

Hier präsentieren wir die erste de novo Genom-Zusammensetzung der Nomura-Qualle (Nemopilema nomurai; Abb. 1b). Das Ergebnis ist ein 213 MB großes Genom, das aus 255 Gerüsten und einer N50-Länge von 2,71 MB besteht und nur 1,48 % Lücken enthält (Additional file 1: Tabellen S2 und S3). Das Nemopilema-Hybrid-Assembly wurde mit einer Kombination aus Short- und Long-Read-Sequenzierungstechnologien erstellt, bestehend aus 38,2 Gb Pacific Biosciences (PacBio) Single-Molecule-Real-Time-Sequencing (SMRT)-Reads sowie 98,6 Gb Illumina Short-Insert-, Mate-Pair- und TruSeq-Synthetic-Long-Reads (Additional file 1: Figures S3-S5; Tables S4-S7). Der resultierende Aufbau zeigt die längste Kontinuität unter den Nesseltiergenomen (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S9). Durch die Kombination von de novo (unter Verwendung von Transkriptomen der Medusenglocke und des Tentakelgewebes) und homologen Genvorhersagemethoden wurden 18.962 proteinkodierende Quallengene vorhergesagt (Zusatzdatei 1: Tabellen S10 und S11, Zusatzdateien 2 und 3). Mit diesem Verfahren wurde die höchste Anzahl an orthologen Genen mit nur einer Kopie unter allen bisher veröffentlichten Genomassemblies von Nicht-Bilateralen Metazoen gefunden (Additional file 1: Tabelle S12). Es wurde festgestellt, dass insgesamt 21,07 % des Quallengenoms aus transponierbaren Elementen bestehen, verglichen mit denen von Acropora digitifera (9,45 %), Nematostella vectensis (33,63 %) und Hydra vulgaris (42,87 %) (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S13).

Wir verglichen das Nemopilema-Genom mit den Genomen anderer Nesseltiere, einschließlich der kürzlich veröffentlichten Genome von Aurelia aurita und Clytia hemisphaerica, die alle von überwiegend sessilen Taxa stammen, um einzigartige Funktionen (aktive Mobilität), physische Strukturen (Medusenglocke) und chemische Eigenschaften (Gift) von Scyphozoa zu ermitteln. Außerdem führten wir Transkriptomanalysen von Nemopilema nomurai und der Qualle Sanderia malayensis über drei Medusengewebetypen und vier Entwicklungsstadien durch.

Evolutionsanalyse der Qualle

Um quallenspezifische evolutionäre Merkmale zu identifizieren, untersuchten wir die Expansion und Kontraktion von Genfamilien bei einem einzelligen Holozoon und 13 Metazoen anhand von 18.458 orthologen Genfamilien (siehe Additional file 1: Abschnitt 4.1). Von diesen wurden 10.434 in Nemopilema gefunden und 6764 wurden von allen drei verfügbaren Nesseltierklassen (Scyphozoa: Nemopilema nomurai und Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera und Nematostella vectensis ; Abb. 2a). Eine anhand dieser Orthologe erstellte Phylogenie ergab eine monophyletische Nesseltiergruppe, die sich vor der Evolution der Bilateralen vom Stamm der Metazoen abspaltete (Abb. 2b; Zusatzdatei 1: Abbildung S7). Um festzustellen, wie viele Gene in jeder evolutionären Ära im Genom von Nomuras Qualle auftauchten, haben wir auch das evolutionäre Alter der proteinkodierenden Gene bewertet. Bei der Einteilung der Quallengene in drei große evolutionäre Epochen stellten wir fest, dass die Mehrheit (80 %) der Gene uralt ist (älter als 741 Mya), einige wenige (~ 3 %) ein mittleres Alter haben (741-239 Mya) und einige (17 %) jung sind (239 Mya bis heute; Abb. 2c; Zusatzdatei 1: Abbildung S10). Interessanterweise deutet die Normalisierung der Anzahl der Gene durch das Alter und die Länge der evolutionären Ära darauf hin, dass der Genumsatz in der Nähe der Gegenwart am höchsten ist. Insgesamt enthielt das Nemopilema-Genom 123 erweiterte und 164 verkleinerte Genfamilien im Vergleich zum gemeinsamen Vorfahren von Nemopilema und Aurelia (Abb. 2b; siehe Additional file 1: Abschnitt 4.2). Gene Ontology (GO)-Terme, die sich auf die sensorische Wahrnehmung beziehen, waren in der Cnidaria-Linie im Vergleich zu Bilateria unterrepräsentiert, was das weniger komplexe sensorische System der Cnidaria widerspiegelt (Additional file 1: Tabellen S14 und S15). Der Neurotransmittertransport (GO:0006836, P = 6.01E- 10) war jedoch in der Scyphozoa-Linie im Vergleich zum gemeinsamen Vorfahren von Scyphozoa und Hydrozoa signifikant angereichert (Zusätzliche Datei 1: Tabellen S16 und S17), was wahrscheinlich auf die Gleichgewichts- und Sehstrukturen, wie die Statozyste und die Ocelli, zurückzuführen ist, die in der beweglichen Medusa ausgefeilter sind als in den sessilen Polypen. Im Vergleich zum gemeinsamen Vorfahren von Nemopilema und Aurelia wies Nemopilema erweiterte Genfamilien auf, die mit Metallopeptidase-Aktivitäten assoziiert sind (GO:0008237, P = 2.86E- 14; Zusatzdatei 1: Tabellen S18 und S19). Außerdem fanden wir 1589 orthologe Genfamilien, die spezifisch für Scyphozoa sind. Anreicherungstests von Scyphozoen-spezifischen Genen zeigten die Begriffe Natrium-Ionentransport, Ionenkanalaktivität und Neurotransmitter-Rezeptoraktivität (Zusatzdatei 1: Tabelle S20).

Genomischer Kontext und muskelassoziierte Gene

Quallen haben zwei primäre Muskeltypen: Die epitheliomuskulären Zellen, die die vorherrschenden Muskelzellen bei sessilen Nesseltieren sind, und die quergestreiften Muskelzellen, die sich in der Medusenglocke befinden und für das Schwimmen unerlässlich sind. Um die Evolution des aktiven Schwimmens bei Quallen zu verstehen, untersuchten wir ihren Codon Bias im Vergleich zu anderen Metazoen, indem wir den Guanin- und Cytosin-Gehalt an der dritten Codon-Position (GC3) berechneten (Additional file 1: Abbildung S13). Es wurde vermutet, dass Gene mit einem hohen GC3-Gehalt anpassungsfähiger an externe Stressfaktoren (z. B. Umweltveränderungen) sind. Unter den 100 am höchsten bewerteten GC3-beeinflussten Genen, der Regulierung der Muskelkontraktion und der Neuropeptid-Signalwege waren GO-Terme spezifisch für Nemopilema (Additional file 4: Tabellen S25 und S26). Kalzium spielt eine Schlüsselrolle bei der Muskelkontraktion in Quallen, und der Kalzium-Signalweg (GO:0004020, P = 5.60E- 10) zeigte ein hohes Maß an GC3-Vorgängen, die spezifisch für Nemopilema sind. Die 500 wichtigsten GC3-Gene von Nemopilema und Aurelia waren in GO-Begriffen angereichert, die mit der Homöostase in Verbindung stehen (z. B., (z.B. zelluläre chemische Homöostase und Natrium-Ionentransport), was vermutlich für die Aktivierung der Muskelkontraktionen, die das mobile Raubtier der Qualle antreiben, wesentlich ist (Additional file 1: Abschnitt 5.1; Additional file 4: Tabellen S27 und S28).

Da Nesseltiere keine Titin- und Troponin-Komplexe haben, die entscheidende Komponenten der quergestreiften Muskeln von Bilateria sind, wurde vermutet, dass die beiden Gruppen unabhängig voneinander quergestreifte Muskeln entwickelt haben. Eine Untersuchung von Genen, die für strukturelle und regulatorische Muskelproteine in Nesseltieren kodieren, zeigte eine konservierte Aktin-Myosin-Kontraktionsmaschinerie der Eumetazoen, die sie mit den Bilateralen teilen (Additional file 1: Table S32). Wie anderen Nesseltieren fehlen Nemopilema jedoch Titin- und Troponin-Komplexe, die Schlüsselkomponenten der quergestreiften Muskeln der Bilateralen sind. Auch γ-Syntrophin, ein Bestandteil des Dystroglykan-Komplexes, fehlte in Nemopilema, Aurelia und Hydra. Nemopilema und Aurelia besitzen jedoch α/β-Dystrobrevin und α/ε-Sarcoglycan, dystroglykan-assoziierte Costamere-Proteine, was darauf hindeutet, dass mehrere Komponenten des Dystroglykan-Komplexes nach der Scyphozoa-Hydrozoa-Spaltung verloren gingen. Es wurde vermutet, dass Hydra im Vergleich zu Nematostella, das eine stärkere Spezialisierung der Muskelzellen aufweist, sekundäre Vereinfachungen erfahren hat. Im Vergleich zu Hydra und Nematostella zeigen Nemopilema und Aurelia eine mittlere Komplexität der strukturellen und regulatorischen Muskelproteine zwischen Hydra und Nematostella.

Transkriptom-Profilierung von Medusenglocken und Tentakeln

Quallenglocken und -tentakeln sind morphologisch verschieden und erfüllen unterschiedliche physiologische Funktionen. Wir erstellten Transkriptome der Glocken und Tentakel von Nemopilema und der kleineren Sanderia malayensis, die im Labor gezüchtet werden können, um die Entwicklungsregulation zu bewerten (Additional file 1: Tabelle S29). Anreicherungstests von hochexprimierten Genen zeigten, dass muskelassoziierte Funktionskategorien (z. B. Muskelmyosinkomplex und Muskelgewebsmorphogenese) in der Glocke angereichert waren (Abb. 3a; Zusatzdatei 5: Tabellen S30-S33). Myosine bilden eine Superfamilie von Motorproteinen und spielen eine entscheidende Rolle bei der Muskelkontraktion und sind an einer Vielzahl von Motilitätsprozessen in Eukaryonten beteiligt. Vor allem die Proteine der Myosin-II-Familie, die sowohl in Zellen der quergestreiften als auch der glatten Muskulatur vorkommen, sind für die Kontraktion der Muskelzellen verantwortlich. Nesseltiere besitzen sowohl epitheliomuskuläre Zellen als auch quergestreifte Muskelzellen. Die quergestreifte Muskulatur ist ein wichtiger Bestandteil der Subumbrella der Medusenglocke, wo ihre schnellen Kontraktionen das einzigartige, auf Vortrieb basierende Schwimmen der Qualle ermöglichen. Wir fanden heraus, dass die Genfamilien der schweren Myosinkette (MYH) und der leichten Myosinkette (MYL) in der Glocke stark ausgeprägt sind und eng mit quergestreiften und glatten Muskelzellen verbunden sind. Interessanterweise wiesen Nemopilema und Aurelia die höchsten Kopienzahlen von MYH- und MYL-Genen unter den nicht-bilateralen Metazoen auf (Abb. 3c; Additional file 1: Figures S14-S17; Tables S38-40), und sechs der sieben MYH-Gene und 12 der 21 MYL-Gene in Nemopilema zeigten eine höhere Expression in der Glocke als in den Tentakeln mit einer sehr hohen durchschnittlichen Steigerung um das 8,8- bzw. 17-fache (Abb. 3d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination von Kopienzahl-Expansion der Typ-II-Myosin-Genfamilien und hoher Expression von muskelassoziierten Genen bestätigt, dass die Muskeln in der Medusenglocke eine wichtige Determinante der Quallenmotilität sind.

Umgekehrt ergaben Genexpressionsanalysen der Tentakel hohe RNA-Expressionsniveaus von Neurotransmitter-assoziierten Funktionskategorien (Ionenkanalkomplex, Postsynapse und Neurotransmitterrezeptoraktivität; Abb. 3b; Additional file). 3b; Additional file 5: Tables S34-S37); dies steht im Einklang mit der Anatomie der Quallententakel, die die Sinneszellen und einen losen Plexus der neuronalen Subpopulation an der Basis des Ektoderms enthalten.

Körpermusterung bei Quallen

Es gab viele Diskussionen über die frühe Evolution der Körpermusterung beim gemeinsamen Vorfahren der Metazoen, insbesondere über den Ursprung und die Ausbreitung der Hox- und Wnt-Genfamilien. Insgesamt wurden 83 Homöodomänen in Nemopilema gefunden, während 82, 41, 120 und 148 Homöodomänen in Aurelia, Hydra, Acropora bzw. Nematostella gefunden wurden (Additional file 1: Table S41). Fünf der acht Hox-Gene in Nemopilema sind vom posterioren Typ, die mit der Entwicklung der aboralen Achse in Verbindung stehen und mit den posterioren Hox-Genen von Nematostella, HOXE und HOXF, geclustert sind (Zusatzdatei 1: Abbildungen S18-S20). Aurelia hat sechs Hox-Gene des posterioren Typs, aber nicht die des HOXB-, C- und D-Typs (HOX2 beim Menschen). Obwohl sie in Hydra und Acropora fehlen, zeigen Syntenie-Analysen der ParaHox-Gene in Nemopilema, dass das XLOX/CDX-Gen unmittelbar stromabwärts von GSX in der gleichen Tandem-Orientierung wie in Nematostella liegt, was darauf hindeutet, dass XLOX/CDX im gemeinsamen Vorfahren der Nesseltiere vorhanden war und später in einigen Linien verloren ging (Zusatzdatei 1: Abbildung S21). Hox-verwandte Gene, EVX und EMX, sind auch in Nemopilema und Aurelia vorhanden, während sie in Hydra fehlen. In Anbetracht der großen Vielfalt der Wnt-Gene in den Vorfahren wurde vorgeschlagen, dass die Wnt-Signalübertragung die Entwicklung des Körperbaus in den frühen Metazoen kontrollierte. Nemopilema besitzt 13 Wnt-Orthologe, die 10 Wnt-Unterfamilien repräsentieren (Additional file1: Abbildung S22; Tabelle S42). Wnt9 fehlt bei allen Nesseltieren, was wahrscheinlich auf Verluste bei den gemeinsamen Vorfahren der Nesseltiere zurückzuführen ist. Bei den Nesseltieren kam es zu dynamischen, stammesspezifischen Verdoppelungen der Wnt-Unterfamilie, wie z. B. Wnt8 (Nematostella, Acropora und Aurelia), Wnt10 (Hydra) und Wnt11 und Wnt16 (Nemopilema und Aurelia). Es wurde vorgeschlagen, dass eine gemeinsame Gruppe von Wnt-Genen (Wnt1-Wnt6-Wnt10) im letzten gemeinsamen Vorfahren der Arthropoden und Deuterostomier existiert. Unsere Analysen der Genome von Nesseltieren und Bilateralen ergaben, dass Acropora dieses Cluster ebenfalls besitzt, während Nemopilema, Aurelia und Hydra Wnt6 fehlt, was auf den Verlust des Wnt6-Gens im gemeinsamen Vorfahren der Medusozoa hindeutet (Additional file 1: Abbildung S23). Insgesamt verfügen die Quallen über eine vergleichbare Anzahl von Hox- und Wnt-Genen wie andere Nesseltiere, aber das dynamische Repertoire dieser Genfamilien deutet darauf hin, dass sich die Nesseltiere unabhängig voneinander entwickelt haben, um ihre physiologischen Eigenschaften und ihren Lebenszyklus anzupassen.

Übergang vom Polyp zur Medusa bei Quallen

Der Übergang vom Polyp zur Medusa ist bei Quallen im Vergleich zu anderen sessilen Nesseltieren besonders ausgeprägt. Um die genetische Grundlage der Medusenbildung bei Quallen zu verstehen, verglichen wir die Transkriptionsregulation zwischen Nesseltieren und zwischen den Entwicklungsstadien von Quallen (siehe Zusatzdatei 1: Abschnitte 7.1 und 7.2). Wir haben die Sanderia-Transkripte anhand von sechs gepoolten Transkriptom-Proben zusammengestellt (Zusatzdatei 1: Tabelle S43). Die assemblierten Transkripte hatten eine Gesamtlänge von 61 Mb und ergaben 58.290 Transkript-Isoformen und 43.541 einzigartige Transkripte, mit einer N50 von 2325 bp. Im Durchschnitt wurden 87 % der RNA-Reads an die assemblierten Transkripte angeglichen (Zusatzdatei 1: Tabelle S44), was darauf hindeutet, dass die Transkript-Assembly die Mehrheit der sequenzierten Reads repräsentierte. Außerdem war die Zusammensetzung der Proteindomänen, die in den ersten 20 Rängen enthalten waren, bei Nemopilema und Sanderia recht ähnlich (Zusatzdatei 1: Tabelle S45). Um differenziell exprimierte Gene für jedes Stadium zu erhalten, verglichen wir jedes Stadium mit dem vorherigen oder nächsten Stadium im Lebenszyklus der Qualle. Das Polypenstadium, das ein sessiles Stadium im Lebenszyklus der Quallen darstellt, zeigte angereicherte Terme, die mit der Aktivität von Ionenkanälen und dem Energiestoffwechsel zusammenhängen (Regulierung von Stoffwechselprozessen und Aminozucker-Stoffwechselprozessen; Additional file 1: Tabelle S46). Die aktive Nahrungsaufnahme im Polypen stimuliert die ungeschlechtliche Vermehrung entweder in weitere Polypen oder die Metamorphose zu Strobila. Da Anthozoen keine Medusen bilden, ist das asexuelle Fortpflanzungsstadium der Strobila ein wichtiges Stadium, um die Metamorphose vom Polypen zur Meduse zu untersuchen. In diesem Stadium waren GO-Terme, die mit der Biosynthese und dem Stoffwechsel von Amiden zusammenhängen, im Vergleich zum Polypenstadium stark ausgeprägt (Additional file 1: Tabelle S47). Es wurde berichtet, dass die Neuropeptide RF-Amid und LW-Amid mit der Metamorphose bei Nesseltieren in Verbindung gebracht werden. Wir konnten diesen Befund jedoch in unseren Strobila- und Ephyra-Stadienvergleichen nicht bestätigen. In unserem System sind die Genexpressionsmuster der beiden Stadien recht ähnlich. In der Ephyra, dem freigesetzten mobilen Stadium, wurden GO-Terme, die mit der Biosynthese und dem Stoffwechsel von Amiden zu tun haben, im Vergleich zum fusionierten Medusenstadium ebenfalls stark exprimiert (Additional file 1: Tabelle S48). In der Medusa waren extrazelluläre Matrix, Metallopeptidase-Aktivität und Immunsystem-Prozess-Terme angereichert (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S49), was mit der Physiologie ihrer Glocke, Tentakel und oralen Arm-Gewebetypen übereinstimmt.

Polyp-zu-Medusa-Metamorphose wurde zuvor gezeigt, dass sie stark mit CL390 und Retinoid-X-Rezeptor (RXR)-Genen in der Aurelia aurita-Qualle verbunden ist. Interessanterweise wurde CL390 weder bei Nemopilema noch bei anderen Nesseltieren gefunden, was darauf hindeutet, dass es sich um ein Aurelia-spezifisches Strobilationsinduktionsgen handeln könnte. Wir bestätigen jedoch, dass RXR in Nemopilema vorhanden ist und in Nesseltieren ohne Medusenstadium fehlt (Additional file 1: Abbildung S24). Retinsäure (RA) spielt eine zentrale Rolle während des Wachstums und der Entwicklung von Wirbeltieren, wo sie die Transkription reguliert, indem sie mit dem RA-Rezeptor (RAR) interagiert, der an RA-Response-Elemente (RAREs) von nahe gelegenen Zielgenen gebunden ist. Von den Genen im RA-Signalweg besitzt Nemopilema die Enzyme ADH und RALDH, die Retinol in RA umwandeln, sowie RXR und RAREs zur Aktivierung der Transkription des Zielgens (Abb. 4a). Wir entdeckten 1630 Nemopilema-RARE-Regionen mit einem durchschnittlichen Abstand von 13 Kbp zum nächstgelegenen Gen (Abb. 4b; Zusatzdatei 1: Tabellen S50 und S51). Interessanterweise befanden sich vier posteriore Hox-Gene von Nemopilema und zwei Hox-Gene von Aurelia innerhalb von ± 10 Kbp von RAREs, was unter den nicht-bilateralen Metazoen einzigartig ist (Abb. 4c; Additional file 1: Tabelle S52). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Retinsäure-Signale in frühen Metazoen vorhanden waren, um Zielgene mit RXR und RAREs zu regulieren, und dass RXR und RAREs eine entscheidende Rolle für die Metamorphose von Polypen zu Medusen spielen können.

Identifizierung von Toxin-verwandten Domänen in Quallen

Quallen produzieren komplexe Mischungen von proteinhaltigen Giften zum aktiven Beutefang und zur Verteidigung. Im Vergleich zu den Gensätzen der nicht-bilateralen Metazoen in der Tox-Prot-Datenbank konnten wir in Nemopilema eine Vielzahl von Toxin-Domänen identifizieren. Insgesamt wurden 67 von 136 Toxindomänen mit nicht-bilateralen Metazoen abgeglichen; von diesen 67 Toxindomänen wurden 52 in Nemopilema gefunden (Additional file 1: Tabelle S53). Erwartungsgemäß enthält das Genom von Nemopilema die größte Anzahl von Gift- oder Toxin-assoziierten Domänen unter den einbezogenen nicht-bilateralen Metazoen. Zu diesen Domänen gehören Zinkmetalloproteasen der Familie Reprolysin (M12B) (PF01421), Phospholipase A2 (PF05826) und Prokineticin (PF06607) (Abb. 5). Außerdem besitzen Nemopilema und Aurelia 8 bzw. 11 ShK-Domänen-ähnliche (PF01549) Domänen, die bei diesen Arten im Vergleich zu anderen Nicht-Bilateralen am häufigsten vorkommen. Insbesondere die Zinkmetalloproteasen der Reprolysin (M12B)-Familie sind peptidspaltende Enzyme und bilden die meisten Schlangengift-Endopeptidasen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Serinprotease-Inhibitor- und ShK-Domänen in den Transkriptomen sowohl der Kanonenkugelqualle (Stomolophus meleagris) als auch der Ohrenqualle (Chironex fleckeri) reichlich gefunden wurden, und Phospholipase A2 ist ein gut charakterisiertes toxinverwandtes Enzym, das für die Produktion von Giftkomponenten entscheidend ist und in der Klasse der Scyphozoa gefunden wurde.