Tiere

Alle Mäuse waren zum Zeitpunkt der Untersuchung 3-11 Monate alte C57BL/6-Männchen. Die Mäuse wurden von Jackson Laboratories erworben, in einer temperatur- (22 °C) und lichtkontrollierten Einrichtung untergebracht und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Mäuse wurden mit einer Überdosis Isofluran eingeschläfert. Alle Tierversuche und deren Verwendung wurden vom Institutional Review Committee der East Carolina University genehmigt. Die Pflege der Tiere entsprach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Institut für Labortierressourcen, Kommission für Biowissenschaften, Nationaler Forschungsrat (Washington: National Academy Press, 1996).

FDB-Dissektion

Eine sorgfältige Dissektion, die eine Beschädigung des Muskels verhindert (der Muskel ist von einem Bereich dichten Bindegewebes umgeben), ist für jedes Verfahren, bei dem der FDB verwendet wird, von entscheidender Bedeutung (siehe Abb. 1). Zur Erleichterung der Dissektion wurden die Zehen an eine Korkplatte geheftet, wobei der Fuß mit der Fußsohle nach oben fixiert wurde. Anschließend wurde die Haut am proximalen Ende des Fußes (oberhalb des Fersenbeins) eingeklemmt, so dass mit einer Mikroschere Einschnitte entlang der seitlichen Fußränder bis hinunter zu den Zehen vorgenommen werden konnten. Während die Haut oberhalb des Fersenbeins eingeklemmt wurde, trennte man mit einer Mikroschere die Haut von der darunter liegenden Muskulatur. Der verbleibende Hautlappen wurde zurückgeschält und entfernt, um den FDB und die Sehnen der Zehen freizulegen. Dann wurde die proximale Sehne durchtrennt, und während die Sehne mit einer Zange festgehalten wurde, wurde die FDB von der darunter liegenden Faszie abgeschnitten. Anschließend wurden die Zehensehnen durchtrennt, um die FDB vom Fuß zu lösen.

Myofaserisolierung

Nach der Präparation der FDB wurden die Muskeln in frisches Kulturmedium (DMEM mit Glutamin, 2% steril-gefiltertes FBS, 0.1% Gentamycin), ergänzt mit 4 mg/ml Kollagenase A (Roche – 11088793001), für 90-120 min bei 37 °C und 5% CO2, wie zuvor beschrieben. Der FDB-Muskel wurde in 2 ml Kulturmedium ohne Kollagenase gegeben und mit dem abgeschnittenen Ende einer P1000-Pipettenspitze vorsichtig gegen die Wand der Schale gerieben, um die Fasern aus dem Bündel zu lösen. Isolierte Myofasern wurden auf Glasbodenschalen geklebt, die mit Entactin-Collagen-Laminin (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore) beschichtet waren. Die Fasern wurden mehrere Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 gelagert und anschließend wie unten beschrieben abgebildet.

FDB-Muskelfaserlänge

Die FDB-Muskeln von männlichen und weiblichen C57BL/6-Mäusen wurden an der proximalen Sehne und den drei medialen Zehensehnen mit Seidennähten abgebunden und an einer Metallklammer befestigt, um die Ruhespannung aufrechtzuerhalten. Die Myofasern wurden wie oben beschrieben isoliert, aber nicht auf Glasbodenplatten aufgeklebt. Die Myofasern wurden mit einem ×4-Objektiv und einem EVOS XL-Kernmikroskop sowie der dazugehörigen Software (Life Technologies, Bothell, WA) abgebildet. Die Längen von etwa 1000 Myofasern wurden in ImageJ (Version 1.6.0, NIH, Bethesda, MD) gemessen. Nach der Isolierung standen die Myofasern nicht mehr unter Spannung und wiesen daher keine optimale Länge auf. Um dieser Änderung der Myofaserlänge Rechnung zu tragen, wurde ein Umrechnungsfaktor auf der Grundlage der Sarkomerlänge verwendet, wie zuvor von Dr. Richard Lieber beschrieben. Bei optimaler Länge wird davon ausgegangen, dass die optimale Sarkomerlänge eines Myofasers im Mausmuskel 2,5 μm beträgt. Um die Myofaserlängen auf die Sarkomerlänge zu normalisieren, haben wir die Sarkomerlänge in einer Untergruppe von 30 Myofasern gemessen. Der Abstand zwischen 10 Sarkomeren jeder Myofaser wurde gemessen, und eine durchschnittliche Sarkomerlänge wurde für alle 30 Myofasern berechnet. Die optimale Sarkomerlänge (2,5 μm) geteilt durch die durchschnittlich gemessene Sarkomerlänge ergab einen Umrechnungsfaktor von 1,14, der zur Normalisierung aller gemessenen Myofaserlängen auf die optimale Sarkomerlänge verwendet wurde.

Individueller Fasertyp und Fasergröße

Die Analyse des Muskelfasertyps des FDB wurde an Proben von C57BL/6-Mäusen durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Die Schnitte wurden mit primären Antikörpern gegen die schwere Myosinkette Typ I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) und Anti-Dystrophin (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA) untersucht und dann mit einem EVOS FL auto Mikroskop und der dazugehörigen Software (Life Technologies, Bothell, WA) abgebildet. Fasertyp und Faserquerschnittsfläche (CSA) wurden mit ImageJ bewertet, wie zuvor beschrieben.

Isometrische Kraftproduktion

Isometrische Kraftproduktion und Ermüdung wurden in EDL- (n = 5), Soleus- (n = 4) und FDB- (n = 6) Muskeln von C57BL/6-Mäusen bewertet, wie zuvor mit leichten Änderungen beschrieben. Der FDB wurde freigelegt und die proximale Sehne mit Seidenfäden befestigt. Eine feine Pinzette wurde unter die drei medialen Zehensehnen gelegt und sanft nach unten in Richtung der Zehen gezogen, bevor die drei Sehnen (Abb. 1) mit Seidennaht gesichert wurden. Wir haben die drei medialen Sehnen abgebunden, weil es aufgrund der anatomischen Lage nicht möglich ist, eine der Zehen abzubinden, und das Abbinden der vierten Sehne führt unserer Erfahrung nach nicht zu einer anderen absoluten Kraft (Daten nicht gezeigt). Jede Sehne wurde dann knapp über dem Knoten durchtrennt, und der FDB wurde vorsichtig vom Fuß abgehoben. Mit einer Mikroschere wurde das restliche Bindegewebe entfernt und vom Fuß gelöst. Der Muskel wurde dann an einen Kraftaufnehmer gebunden und in sauerstoffhaltigem Krebs-Ringer-Puffer (KRB – 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) bei Raumtemperatur suspendiert. Die Muskellänge wurde dann so lange eingestellt, bis der FDB eine maximale Zuckungskraft erzeugte, woraufhin die optimale Ruhespannung (Lo) eingestellt und der Muskel 10 Minuten lang ausbalanciert wurde. Soleus-Muskeln wurden vorbereitet, indem ein doppelter quadratischer Knoten an der distalen Soleus-Sehne geknüpft wurde. Die Sehne wurde oberhalb des Knotens durchtrennt, und die hinteren Muskeln wurden vorsichtig vom Bein weggezogen, wobei die proximale Soleus-Sehne zum Vorschein kam, die mit einem doppelten quadratischen Knoten abgebunden wurde. Der EDL wurde wie zuvor beschrieben durchtrennt und abgebunden. EDL und Soleusmuskeln wurden 10 Minuten lang in sauerstoffangereichertem KRB bei Raumtemperatur mit Ruhespannung äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wurde die Muskelspannung optimiert, indem maximale Zuckstimulationen durchgeführt und die Muskellänge angepasst wurde, bis die Spitzenkraft erreicht war. Die Zuckungsstimulationen wurden im Abstand von 30 Sekunden durchgeführt, um eine Ermüdung des Muskels zu vermeiden. Anschließend wurden die Muskeln im Abstand von 60 Sekunden mit 10, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 Hz stimuliert, um eine Kraftfrequenzkurve zu erstellen. Die Muskeln wurden zusätzlich 1 Minute lang geruht, bevor ein 10-minütiges Stimulationsprotokoll zur Bestimmung der Ermüdungsresistenz absolviert wurde. Das Ermüdungsprotokoll stimulierte die Muskeln mit 30 Hz alle 2 s über einen Zeitraum von 600 s für insgesamt 300 Kontraktionen. Die optimale Muskellänge wurde aufgezeichnet und die Muskeln wurden abgetupft, um überschüssiges KRB zu entfernen, bevor sie gewogen wurden. Vor den Experimenten wurde eine optimale Spannung von 20 V festgelegt, um eine maximale Stimulation von FDB, EDL und Soleus zu gewährleisten (Daten nicht gezeigt). Die Daten der absoluten Muskelkraft wurden in spezifische Kraft (N/cm2) umgerechnet, wobei zuvor beschriebene Gleichungen für die mathematische Schätzung der Muskel-CSA und der physiologischen Querschnittsfläche (PCSA) verwendet wurden. Der Hauptunterschied zwischen CSA und PCSA besteht in der Einbeziehung des Verhältnisses von Muskelfaserlänge zu Muskellänge in die PCSA-Gleichung. Wir haben beide korrigierten Methoden verwendet, um eine größere Kompatibilität mit der Literatur zu erreichen.

Passive kontraktile Eigenschaften

Passive kontraktile Eigenschaften wurden in EDL- und FDB-Muskeln von männlichen C57BL/6-Mäusen (n = 4), wie zuvor beschrieben, mit leichten Änderungen bewertet. Die EDL- und FDB-Muskeln wurden zerlegt und wie oben beschrieben an einen Kraftaufnehmer gebunden. Die Muskeln wurden 10 Minuten lang in sauerstoffhaltigem KRB bei Raumtemperatur äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wurde die Muskelspannung optimiert, indem maximale Zuckungsstimulationen durchgeführt und die Muskellänge angepasst wurde, bis die Spitzenkraft erreicht war. Die Zuckungsstimulationen wurden im Abstand von 30 s durchgeführt, um eine Ermüdung des Muskels zu vermeiden. Die Referenzlänge des Muskels wurde als Lo gemessen, bevor eine passive Dehnung von 105, 110, 115, 120, 125 und 130 % von Lo durchgeführt wurde. Die Muskeln wurden abgetupft, um überschüssige KRB zu entfernen, und dann gewogen. Die Daten wurden auf CSA und PCSA korrigiert.

Kardiotoxin (CTX)-Verletzung

Vergleiche wurden bei C57BL/6-Mäusen zwischen einem CTX-behandelten FDB (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) und einem PBS-behandelten kontralateralen FDB 4 Tage (n = 4) und 10 Tage nach der Behandlung (n = 2) durchgeführt. Sterile 8-mm-lange 31G-Spritzen wurden mit 10 μL 10 μM CTX oder 10 μL sterilem 1× PBS, wie zuvor beschrieben, vorbereitet. Nach der Isofluran-induzierten Anästhesie wurden die Fußsohlen von vier Mäusen mit Alkoholtüchern gereinigt. CTX wurde in den proximalen Teil des Fußes injiziert, wobei die Nadel unter die Haut und in Richtung der Zehen geführt wurde. In den kontralateralen Fuß wurde PBS injiziert. Die Mäuse wurden zum entsprechenden Zeitpunkt getötet, und die FDBs wurden für die Messung der Kraftproduktion, wie oben beschrieben, seziert. Die Daten wurden auf PCSA korrigiert.

Hematoxylin- und Eosinfärbung

FDB-Muskeln, die einer 10-tägigen CTX-Behandlung unterzogen worden waren, wurden zum Schneiden und zur H&E-Färbung, wie zuvor beschrieben, in einer Lösung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) eingefroren.

Hochauflösende mitochondriale Respirometrie der Skelettmuskulatur

Präparation von permeabilisierten Gastrocnemius- und FDB-Muskelfaserbündeln

Die Respirometrie wurde an isolierten permeabilisierten Gastrocnemius- und FDB-Muskelbündeln durchgeführt, die aus derselben Extremität von C57BL/6-Mäusen (n = 4) entnommen wurden. Ein Teil des roten Gastrocnemius wurde herausgeschnitten und für die Vorbereitung der permeabilisierten Faserbündel verwendet, wie zuvor beschrieben. Der rote Gastrocnemius-Muskel wurde als Vergleichsgewebe verwendet, da er üblicherweise zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung des murinen Skelettmuskels eingesetzt wird. Das Protokoll zur Herstellung von permeabilisierten FDB-Muskelfaserbündeln wurde an die zuvor beschriebenen Methoden zur Permeabilisierung von roten Gastrocnemius-Muskelbündeln angepasst und wird im Folgenden beschrieben. Die FDBs wurden seziert und sofort in eiskalten Puffer X (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 Imidazol, 20 Taurin, 5,7 ATP, 14,3 Phosphokreatin, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O) gegeben. Unter einem Seziermikroskop wurden Bindegewebe, Fett und Blutgefäße vorsichtig entfernt, um Muskelverluste zu vermeiden. Die FDBs wurden in Bündel geschnitten und in Gruppen von drei bis vier Bündeln mit einem Gewicht von 1,5-2,0 mg Nassgewicht aufgeteilt. Die Bündelgruppen wurden dann in Puffer X, der 22,5 μg/ml Saponin enthielt, unter kontinuierlicher Rotation bei 4 °C für 5 Minuten permeabilisiert. Die Muskelbündel wurden umgehend in eiskalten Puffer Z (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) überführt und unter kontinuierlicher Rotation bei 4 °C für 15 min gewaschen.

Mitochondriale Atmung

Messungen des hochauflösenden O2-Verbrauchs wurden mit dem OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich) bei 37 °C mit einer Ausgangssauerstoffkonzentration von ~ 300-350 μM wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die Experimente wurden in Puffer Z durchgeführt, der 20 mM Kreatinmonohydrat und 25 μM Blebbistatin enthielt. Die mitochondriale Atmung wurde durch die sequentielle Zugabe von Substraten mit einer Endkonzentration von Pyruvat 4 mM, Malat 0,5 mM, Glutamat 5 mM, ADP 2.5 mM, Succinat 5 mM, Cytochrom c 5 μM, Rotenon 10 μM, Antimycin A 5 μM, Ascorbinsäure 2 mM und TMPD 0,5 mM (N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylendiamin-Dihydrochlorid). Die Integrität der Mitochondrienmembran wurde durch den Ausschluss von Gastrocnemius-Muskelbündeln und FDB-Muskelbündeln bestätigt, die nach Zugabe von exogenem Cytochrom c eine > 10 bzw. > 20%ige Zunahme der Atmung aufwiesen. Für die Gastrocnemius- und FDB-Muskelbündel wurde ein anderes Ausschlusskriterium verwendet, da vorläufige Tests darauf hindeuteten, dass die FDB-Faserbündel im Vergleich zu den Gastrocnemius-Faserbündeln nach der Zugabe von Cytochrom c eine größere prozentuale Zunahme der Atmung aufwiesen. Nach Abschluss des Protokolls wurden die Muskelbündel in destilliertem H2O gespült, gefriergetrocknet (Labconco, Kansas City, MO) und gewogen (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Die Atmungsraten für intakte Gastrocnemius-Muskelbündel werden üblicherweise auf das Trockengewicht umgerechnet; aufgrund der Unterschiede im Bindegewebsgehalt der beiden Muskelgruppen wurden die JO2-Werte jedoch auch auf das Gesamtprotein und die Citrat-Synthase (CS)-Aktivität umgerechnet. Die CS-Aktivität wurde mit dem Kit CS0720 gemessen. Chemikalien und Reagenzien wurden von Sigma Aldrich bezogen.

Mikroskopie

In vitro

FDB-Muskelfasern wurden aus C57BL/6-Mäusen isoliert und auf 35-mm-Glasbodenschalen angebracht, die mit ECL beschichtet waren, wie zuvor beschrieben. Die isolierten Myofasern wurden 30 Minuten lang mit Mitotracker Deep Red (M2246, Thermo Fisher) und NucBlue (R37605, Thermo Fisher) in DMEM gefärbt. Die Fasern wurden dreimal mit 2 mL KRB gewaschen. Die Fasern wurden mit einem konfokalen Einzelphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop mit einem ×60-Ölimmersionsobjektiv (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35) abgebildet, und die Anregung erfolgte mit den 405- und 488-nm-Linien eines mehrzeiligen Argon-Lasers.

In vivo

Die Erzeugung der zweiten Harmonischen beschreibt den optischen Effekt, der beim Durchgang von Laserimpulsen durch hoch polarisierte, nicht zentralsymmetrische Materialien wie Myosin entsteht. Wenn diese Materialien bei der entsprechenden Wellenlänge polarisiert sind, emittieren sie Licht mit der halben Wellenlänge des eintretenden Lichts, wodurch hochauflösende Bilder erzeugt werden, ohne dass fluoreszierende Sonden benötigt werden, die der Photobleiche und Phototoxizität unterliegen. Darüber hinaus ermöglichen die Wellenlängen des nahen Infrarots ein tiefes Eindringen in das Gewebe, ohne dass invasive Verfahren erforderlich sind. C57BL/6-Mäuse wurden betäubt, bevor die Haut über dem FDB entfernt wurde, um den FDB-Muskel freizulegen. Nach der Freilegung wurde der FDB mit sterilem KRB hydratisiert, und die Maus wurde, wie zuvor beschrieben, in Bauchlage auf ein Glasdeckblatt (#1.5, Leica) gelegt (Abb. 1C). Myosin- und Nikotinamid-haltige Moleküle wurden mit einem modengekoppelten gepulsten Ti:Saphir-Laser (Mai Tai Deep See HP-Serie, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA) bei 900 und 720 nm angeregt, und die Emission wurde mit einem FV10 MRV/G-Filter, der bei 450 bzw. 420 nm eingestellt war, mit nicht-abgetasteter Detektion aufgenommen. Alle Bilder wurden mit einem ×60-Ölimmersionsobjektiv (Plan Apochromat, NA 1,35) und einem Olympus FV1000 LSM mit der Erfassungssoftware FV10-ASW 4.2 aufgenommen.

cDNA-Elektroporation und hochauflösende Respirometrie von Skelettmuskeln, die Pgc1α überexprimieren

Die Elektroporation von cDNA in FDBs wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Füße von sieben männlichen und weiblichen C57BL/6-Mäusen, die betäubt waren, mit einem Alkoholtuch gereinigt, und die Fußballen wurden mit 10 μl 2 mg/mL Hyaluronidase, die in steril gefiltertem KRB suspendiert war, mit einer 8 mm langen sterilen 31-Gauge-Nadel injiziert. Ungefähr 1 Stunde später wurden die Mäuse ein zweites Mal betäubt. Die Füße wurden erneut mit einem Alkoholtuch gereinigt, und in einen Fuß wurden 30 μg eines PGC1α-Plasmids mit grünem Fluoreszenzprotein (GFP) und in den kontralateralen Fuß YFP cDNA injiziert. Nachdem sich die Mäuse vollständig von der Narkose erholt hatten, wurden sie etwa 10 Minuten später ein drittes Mal narkotisiert. Platin-Elektroden wurden unter die Haut eingeführt und senkrecht zur FDB und parallel zueinander an der Ferse und am Fußballen unter den Zehen positioniert. Die FDB wurde mit 20 Impulsen von 20 ms Dauer bei 1 Hz und 100 V stimuliert. Die Mäuse wurden 14 Tage später getötet, und die FDBs wurden seziert und unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, um die Plasmidexpression zu bestätigen. Intakte FDB-Muskelproben wurden dann präpariert und die mitochondriale Atmung wie oben beschrieben gemessen.

Statistik

Datenverteilungen wurden bewertet und Daten, die nicht einer Normalverteilung entsprachen, wurden zur logarithmischen Basis 10 transformiert. Die Kraftfrequenz-Kontraktionsdaten wurden mittels einer Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichen analysiert. Daten zur Muskelmasse, zum Fasertyp, zur Zeit bis zum Maximum und zur Halbrelaxation sowie zur Ermüdung wurden mittels einseitiger ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichen analysiert. In Fällen, in denen die Daten nicht in eine Normalverteilung transformiert werden konnten, wurde ein Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichen durchgeführt. Die ANOVAs wurden mit GraphPad Prism 7.03 durchgeführt. Atmungsdaten und CS-Aktivität wurden mittels gepaarter zweiseitiger t-Tests mit einem Alpha-Niveau von 0,05 in Microsoft Excel analysiert. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben.