Die Identifizierung fadenförmiger Schimmelpilze im klinischen Routinelabor basiert immer noch hauptsächlich auf der mikroskopischen Untersuchung von Sporenkolonien. Pilze, die keine Sporokarpen oder charakteristischen Sporen aufweisen, sind schwer zu identifizieren (Pounder et al. 2007; Santos et al. 2013). In der vorliegenden Studie wurden 13 sterile oder undiagnostische Stämme analysiert. Aufgrund phänotypischer Merkmale wurden die Isolate als Papulaspora-Arten identifiziert, da sie Klumpen oder bulbenartige Strukturen bildeten (Vinod Mootha et al. 2012). Bei Versuchen, die Sporulation mit verschiedenen Substraten und Inkubationsbedingungen zu induzieren, produzierten einige Stämme winzige Konidien auf kurzen Phialiden, aber auch diese Konidien waren diagnostisch nicht brauchbar und konnten nicht zur Speziesidentifikation verwendet werden.
Mit der molekularen und phylogenetischen Analyse von sechs Loci wurde festgestellt, dass die Stämme zu drei neuen Arten gehören, die in der vorliegenden Studie beschrieben werden. Zwei Arten wurden mit der Typusart der Gattung Subramaniula geclustert, während eine Art mit zwei beschriebenen Chaetomium-Arten verwandt ist. Sowohl Subramaniula als auch Chaetomium sind Mitglieder der Familie Chaetomiaceae (Sordariales). Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch die Bildung von Ascosporen in zerfließenden Asci innerhalb von mehr oder weniger stark verzierten Perithecien aus (Whiteside 1961). Die phänotypische Identifizierung der Arten der Chaetomiaceae hängt hauptsächlich von der Form der Ascomatalhaare, der Pigmentierung und Ornamentierung der Ascoma und der Form der Ascosporen ab (Ames 1961; von Arx et al. 1984). Die drei in der vorliegenden Studie beschriebenen Arten weisen ungewöhnliche morphologische Merkmale auf, da sie keine sexuelle Fortpflanzung in den Ascomata bilden. Stattdessen waren Anhäufungen von dickwandigen, dunkel pigmentierten Zellen vorhanden. Es ist unklar, ob diese Strukturen unreife Perithecien darstellen (Davey et al. 2008). Im Rahmen der singulären Nomenklatur für Pilze (Taylor 2011) werden die Arten hier dennoch aufgrund ihrer phylogenetischen Position innerhalb der Chaetomiaceae in sexuellen Gattungen beschrieben.
Die beiden neuen Arten, die zu Subramaniula gehören, stammen aus klinischen Quellen, meist Augen- oder Hautinfektionen. Die koprophile Gattung Subramaniula ist derzeit durch zwei Arten bekannt, die von Achaetomium übertragen wurden, nämlich S. irregularis und die Gattungstypusart S. thielavioides (Cannon 1986; von Arx 1985; von Arx et al. 1978). Die Gattung Subramaniula zeichnet sich durch kahle, blasse Ascomata mit weiten apikalen Öffnungen aus (Abb. 8), ohne dass eine asexuelle Morphe bekannt ist. Cannon (1986) berichtete von „einigen Hyphen mit Ketten aus beträchtlich geschwollenen Zellen, die dünnwandige kugelförmige oder ellipsoidische Körper mit einem Durchmesser von bis zu 8 μm bilden, die aber möglicherweise nicht als Fortpflanzungsorgane dienen“. Einige Autoren vermuteten, dass diese Körper mit dem asexuellen Zustand dieses Pilzes zusammenhängen könnten (Pastirčák und Pastirčáková 2009). Bei der Untersuchung des Ex-Typ-Stamms von S. thielavioides (CBS 122.78) entdeckten wir Ketten von geschwollenen Zellen, aber keine dünnwandigen Körper. Im Vergleich zu unseren beiden neuen Subramaniula-Arten, bei denen Konidien beobachtet wurden, ist es unwahrscheinlich, dass es sich bei diesen Strukturen um die Konidien handelt, sondern sie könnten als Überlebenspropaganda dienen. Subramaniula irregularis (syn. Achaetomiella irregulare) wird als morphologisch ähnlich zu S. thielavioides beschrieben, mit einigen Unterschieden in Form und Größe der Ascosporen und der Pigmentierung der Ascomata, aber für diese Art ist keine lebende Kultur verfügbar (Cannon 1986).
Subramaniula thielavioides (CBS 122.78). Kolonien nach 1 Woche Inkubation auf: a-b MEA Vorder- und Rückseite; c OA; d Ascomata; e Ascomata-Wand; f-h Ascospores. – Skalenbalken = 10 μm
Subramaniula thielavioides wurde aus einer Dungprobe aus Indien isoliert, während S. irregularis nur aus dem Boden in Südafrika bekannt ist (Cannon 1986; von Arx et al. 1978). Bisher wurde noch keine Infektion des Menschen auf Subramaniula zurückgeführt. Cannon (1986) berichtete jedoch über die Isolierung von S. thielavioides aus einem menschlichen Nagel und schrieb interessanterweise: „Medizinische Mykologen sollten sich seiner Existenz bewusst sein“. Mit den beiden neu beschriebenen klinischen Arten wird bestätigt, dass die Gattung Subramaniula ein Potenzial als opportunistische Gattung hat, die möglicherweise Haut-, Augen- und Nagelinfektionen verursacht. Ein nicht identifizierter Stamm aus einem Hornhautgeschwür, der von Vinod Mootha et al. (2012) veröffentlicht wurde, CBS 123294, wird in der vorliegenden Studie als neue Art Subramaniula asteroides beschrieben. Der Stamm wurde von einem Patienten gewonnen, der eine Kontaktlinse trug und bei der Arbeit in einem Pferdestall mit einem Draht verletzt wurde. Der Stamm dH 21571 betraf eine Keratitis, die nach einem Augentrauma mit einem scharfen Pflanzenblatt auf einem landwirtschaftlichen Feld im tropischen Indien auftrat. Zwei weitere Stämme aus den USA wurden ebenfalls aus Hornhautgeschwüren gewonnen. Zwei weitere Stämme aus Augeninfektionen in Spanien passten zu S. asteroides; CNM-CM 4314 wurde aus Hornhautexsudat eines 27-jährigen männlichen Patienten isoliert, CNM-CM 7482 stammte aus einer Endophthalmitis eines 47-jährigen immunsupprimierten Patienten; im Glaskörper wurden Hyphen beobachtet und der Patient verlor das Auge. Subramaniula asteroides scheint also eine starke Assoziation mit traumatischen Augeninfektionen zu haben. Im Verlauf dieser Studie wurde eine weitere Sequenz, die von einem Isolat (UTHSC 03-1315) von der Haut eines Patienten aus Saudi-Arabien stammt, ebenfalls als S. asteroides identifiziert. Das einzige Umweltisolat von S. asteroides stammte ebenfalls aus Saudi-Arabien, und zwar aus sandigem Wüstenboden unter Kohlenwasserstoffeinfluss. Er wurde durch Toluol-Anreicherung gewonnen (Zhao et al. 2010), eine Methode, die für die Isolierung von Pilzen entwickelt wurde, die unter toxischen Bedingungen wachsen.
Subramaniula obscura wird in der vorliegenden Arbeit für einen einzelnen Stamm von einem 53-jährigen kuwaitischen Mann beschrieben, der eine Zeheninfektion hatte. Der Stamm wurde zunächst als Chaetomium cuniculorum identifiziert. Wir fanden heraus, dass Stämme von C. cuniculorum phylogenetisch mit S. obscura verwandt sind, da beide in einer einzigen, unterstützten Klade gefunden wurden, die sowohl auf der ribosomalen Genanalyse (ML-BS/PP, 84 %/1,0) als auch auf der Multilocus-Analyse der proteinkodierenden Gene (ML-BS/PP, 100 %/0,99) basiert (Abb. 2). Mit der ITS-Sequenzierung und unter Verwendung einer begrenzten Anzahl von Taxa könnte die Trennung der beiden Arten tatsächlich schwierig sein. Die ITS-Sequenz des Ex-Typ-Stamms von S. obscura, CBS 132916, wies eine Ähnlichkeit von 97 % mit Isolaten von C. cuniculorum auf. Es wird angenommen, dass die letztgenannte Art hauptsächlich auf Dung vorkommt, und etwa die Hälfte der C. cuniculorum-Stämme in der CBS-Kultursammlung stammt aus dem Dung pflanzenfressender Tiere. Die ITS-Ähnlichkeit von S. obscura mit S. thielavioides beträgt 99,4 %, aber die proteinkodierenden Gene sind durchweg unterschiedlich, so dass die Beschreibung der neuen Art in Subramaniula gerechtfertigt ist.
Die Makro- und Mikromorphologie von Subramaniula obscura ähnelt der von S. asteroides, mit der Ausnahme, dass die Zellen, die die Klumpen von S. obscura bilden, bräunlicher und runder sind und die Hyphen dicker sind und warzenartige Ausstülpungen haben. Die minimale Wachstumstemperatur für beide Arten und für S. thielavioides liegt bei 6 °C, und sie wuchsen alle sehr gut über 40 °C, was auf eine Thermotoleranz der Subramaniula-Arten hindeutet. Das optimale Wachstum lag zwischen 33 und 36 °C, und das konsequente Überleben bei 37 °C weist auf die Fähigkeit hin, bei menschlicher Körpertemperatur zu wachsen, was auf einen Virulenzfaktor hindeutet (Revankar und Sutton 2010).
Die Identifizierung von Chaetomium anamorphosum Stamm CBS 137114 als neue Spezies, die aus menschlicher Peritonitis gewonnen wurde, erfolgte zunächst durch morphologischen Vergleich mit beschriebenen Papulaspora-Spezies. Dieser Stamm zeigte eine gewisse Ähnlichkeit mit Papulaspora nishigaharanas durch die Bildung von Aggregaten aus braunen, dickwandigen Zellen sowie durch die Produktion von Phialoconidien (Watanabe 1991). Ein Vergleich der Sequenzen von ITS und der D1/D2-Region des 28S rRNA-Gens in GenBank ergab keine Homologie mit einer bekannten sequenzierten Art. Mit Hilfe des molekularen phylogenetischen Ansatzes konnten wir die Taxonomie dieses Isolats als einen nahen Verwandten der ascosporulierenden Arten Chaetomium irregulare und C. fusisporum aufklären (Abb. 1, 2 und 9). Die neu identifizierte Art unterschied sich von C. irregulare und C. fusisporum nicht nur in der Morphologie, sondern auch in der Wachstumstemperatur. Das Temperaturoptimum von C. anamorphosum lag bei 33-36 °C und das Wachstum wurde auch bei 40 °C noch beobachtet, während das Optimum von C. irregulare bei 30 °C lag und es bei 40 °C nicht oder nur schlecht wuchs. Chaetomium irregulare wurde von Rodríguez et al. (2004) in die Gattung Achaetomium überführt. Beim Vergleich mit der Gattung Achaetomium globosum wurde jedoch festgestellt, dass diese Art weit entfernt ist und der Name Achaetomium irregulare überflüssig ist. Die Taxonomie und Nomenklatur der Gruppe, die die neue Art und andere Chaetomium spp. als paraphyletisch zu Subramaniula enthält, ist aufgrund des relativ großen Abstands zur Gattungsart C. globosum unklar. Darüber hinaus unterscheidet sich die Morphologie der Ascomata, der Ascosporenhaare (falls vorhanden) und der Ascosporen der Arten dieser Gruppe von derjenigen von C. globosum. Die Gattungen Chaetomium, Achaetomium, Subramaniula und Achaetomiella waren morphologisch ähnlich und unterschieden sich nur geringfügig durch das Vorhandensein oder Fehlen von Ascomatenhaaren, die Wand der Ascoma, die Farbe der Ascosporen und die Wachstumsgeschwindigkeit (Cannon 1986). Diese Merkmale sind aufgrund der Verfügbarkeit molekularer Daten weitgehend irrelevant geworden. Bis zu einer taxonomischen Revision von Chaetomium behalten wir die derzeitige Klassifizierung des Clusters innerhalb dieser Gattung bei, wobei wir Subramaniula als Gattung innerhalb von Chaetomium anerkennen.
Chaetomium irregulare (CBS 446.66). Kolonien auf MEA: a Eine Woche b Vier Wochen Inkubation; c Asci auf der Oberfläche von OA-Agar; d Ascomata; e Ascomata-Wand; f-g Asci; h. Ascosporen. – Skalenbalken = 10 μm
Trotz der großen Anzahl beschriebener Arten bei Chaetomium und Verwandten ist nur wenig über ihre molekulare Taxonomie bekannt und nur wenige Arten wurden sequenziert und sind in öffentlichen Datenbanken verfügbar (Wang et al. 2014). Die meisten früheren Studien beschränkten sich auf seltene Arten, und die Phylogenie der ubiquitäreren Chaetomium-Arten ist nach wie vor ungeklärt (Asgari und Zare 2011; Lee und Hanlin 1999; Wang et al. 2014). Kürzlich wurden drei neue Arten in der C. indicum-Gruppe auf der Grundlage der molekularen Analyse von vier Genen beschrieben (Wang et al. 2014). Eine weitere molekulare Studie über Chaetomium wurde von Asgari und Zare (2011) im Iran durchgeführt, wobei eine phylogenetische Analyse von drei Genen zur Abgrenzung von sechs neuen Arten führte. Zwei davon wiesen asexuelle Morphen auf, die denen von Chaetomium anamorphosum und den beiden in dieser Arbeit beschriebenen Subramaniula-Arten ähneln. Chaetomium rectangulare Asgari und Zare (2011) gehört zur C. globosum-Gruppe, die durch ungeschlechtliche Morphen mit Phialiden und Konidien gekennzeichnet ist, die denen unserer neuen Art sehr ähnlich sind. Dies könnte darauf hindeuten, dass die neuen Arten irgendwie ihre Fähigkeit zur Bildung sexueller Früchte verloren haben und diese durch eine asexuelle Art der Sporenbildung ersetzt haben. Die Sequenzierung des MAT-Locus, der die sexuelle Fortpflanzung steuert, könnte Aufschluss darüber geben, ob die sexuellen Morphen bei diesen Arten fehlen oder unterdrückt werden.
Tiermist, verrottendes Pflanzenmaterial und Erde sind bekannte natürliche Lebensräume für Chaetomium-, Subramaniula- und Papulaspora-Arten. De Hoog et al. (2013b) stellten fest, dass die Gattung Madurella innerhalb von Chaetomium verschachtelt ist und dass viele Arten in den Chaetomiaceae Dung-Assoziationen mit ariden klimatischen Bedingungen verbinden. Durch die Hinzufügung der bisher nicht identifizierten nicht-askosporulierenden Arten zu Chaetomium hat die Rolle dieser Gattung bei Krankheiten von Mensch und Tier erheblich zugenommen. Chaetomium-Infektionen und Infektionen durch Arten, die im phylogenetischen Baum von Chaetomium geclustert sind, wie Chaetomidium und Thielavia, wurden von Haut, Haaren und Nägeln berichtet (Hubka et al. 2011; Kaliamurthy et al. 2011; Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Darüber hinaus wurde berichtet, dass mehrere Arten der Chaetomiaceae schwere opportunistische Infektionen bei immungeschwächten Patienten verursachen (Al-Aidaroos et al. 2007; Guppy et al. 1998; Hoppin et al. 1983). Mehrere Fälle von Peritonitis, die der unseren bei C. anamorphosum ähneln, wurden bei immungeschwächten Personen gemeldet, die die Infektion während einer Peritonealdialyse erworben hatten. Febré et al. (1999) isolierten C. globosum aus Flaschen mit Dialyseflüssigkeit; eine Peritonitis wurde von Baer et al. (2013) berichtet. Ein interessanter Fall, der von Issa et al. (2013) veröffentlicht wurde, betraf eine Peritonitis bei einer immunkompetenten Frau aus Damam, Saudi-Arabien, verursacht durch eine unbekannte Chaetomium-Art. Offenbar sind auch immunkompetente Personen dem Risiko einer tiefen Infektion durch Chaetomium oder verwandte Pilze ausgesetzt. So wurde beispielsweise ein Fall von tödlicher zerebraler Phäohyphomykose, verursacht durch Thielavia subthermophila, bei immunkompetenten Personen gemeldet (Badali et al. 2011). Chaetomium atrobrunneum, C. perlucidum und C. strumarium wurden nun als neurotrope Arten angesehen, die schwere und lebensbedrohliche Infektionen verursachen (Abbott et al. 1995; Barron et al. 2003; Guppy et al. 1998). Es scheint, dass die Mitglieder der Chaetomiaceae tatsächlich ein unterschätztes klinisches Potenzial haben, und eine Neubewertung der Rolle der Gattung in der Humanpathologie ist dringend erforderlich. Der natürliche Lebensraum vieler Arten in trockenen Klimazonen und ihr Überleben bei hohen Temperaturen begünstigen wahrscheinlich ihr Überleben im Gewebe von Säugetieren. Die Fähigkeit von C. anamorphosum, im Gegensatz zu C. irregulare bei 36 °C optimal zu wachsen, ist ein gutes Beispiel. Die Arten sind in der Lage, die thermische Ausschlusszone des menschlichen Körpers zu durchbrechen, und bei Immunsuppression oder anderen immunologischen Problemen können die Pilze als potenzielle Humanpathogene auftreten (Casadevall 2012).
Aufgrund von Identifizierungsschwierigkeiten auf der Grundlage phänotypischer Kriterien wurden einige ältere Fälle von Chaetomium- oder Subramaniula-Arten möglicherweise fälschlicherweise nicht berücksichtigt oder als Fälle von Madurella- oder Papulaspora-Infektionen gemeldet (Mohd-Tahir et al. 2012). Unsere Studien zeigen eindeutig, dass traumatische und opportunistische Infektionen durch Chaetomium-ähnliche Arten in der Kultur häufig nicht oder nur schlecht sporulierende Stämme hervorbringen (Najafzadeh et al. 2014; Vinod Mootha et al. 2012). Die Beschreibung dieser Stämme als separate taxonomische Einheiten innerhalb der Gattung ist sowohl aus klinischer als auch aus epidemiologischer Sicht von Bedeutung. Außerdem gibt es nur wenige Studien zur Empfindlichkeit gegenüber Pilzen, und es werden dringend Behandlungsprotokolle benötigt.