Abstract
Der zelluläre Stoffwechsel hängt von einer angemessenen Konzentration an intrazellulärem anorganischem Phosphat (Pi) ab. Gene, die auf Pi-Mangel reagieren, scheinen an mehreren Stoffwechselwegen beteiligt zu sein, was auf ein komplexes Pi-Regulationssystem in Mikroorganismen und Pflanzen hindeutet. Eine Gruppe von Enzymen ist für die Aufnahme und Aufrechterhaltung eines angemessenen Phosphatspiegels erforderlich, der aus Phosphatestern und -anhydriden freigesetzt wird. Das Phosphatasesystem eignet sich besonders gut für die Untersuchung von Regulationsmechanismen, da die Phosphataseaktivität mit spezifischen Methoden leicht gemessen werden kann und der Unterschied zwischen dem unterdrückten und dem nicht unterdrückten Niveau der Phosphataseaktivität leicht zu erkennen ist. In dieser Arbeit wird das Protein-Phosphatase-System analysiert, das während des Phosphatmangels in verschiedenen Organismen induziert wird.
1. Einleitung
Die Regulierung zellulärer Prozesse, wie z.B. Zelldifferenzierung, Proliferation, Zelltod, Mobilität, Metabolismus, Überleben und Organisation des Zytoskeletts, als Reaktion auf bestimmte Stimuli ist für alle Aspekte des Zelllebens grundlegend. Die Phosphorylierung von Proteinen ist einer der häufigsten Mechanismen zur Regulierung dieser Prozesse. Prozesse, die reversibel durch Proteinphosphorylierung gesteuert werden, erfordern sowohl eine Proteinkinase als auch eine Proteinphosphatase.
Traditionell wurden Proteinkinasen intensiver untersucht als Proteinphosphatasen, da man früher der Ansicht war, dass Proteinkinasen die Proteinphosphorylierung fein regulieren, während Proteinphosphatasen lediglich Phosphatgruppen entfernen. Erst in den letzten zehn Jahren wurde erkannt, dass Proteinphosphatasen ebenfalls durch eine Vielzahl von Mechanismen reguliert werden und für die Zellphysiologie nicht weniger wichtig sind als Proteinkinasen. Proteinphosphatasen sind in der Lage, Phosphomonoester-Stoffwechselprodukte zu hydrolysieren und dabei anorganisches Phosphat (Pi) aus diesen Substraten freizusetzen.
Phosphor, in Form von anorganischem Phosphat (Pi), ist einer der wichtigsten Makronährstoffe für alle Organismen. Es wird nicht nur bei der Biosynthese von Zellbestandteilen wie ATP, Nukleinsäuren, Phospholipiden und Proteinen verwendet, sondern ist auch an vielen Stoffwechselwegen beteiligt, darunter Energietransfer, Proteinaktivierung sowie Kohlenstoff- und Aminosäurestoffwechselprozesse . Große Mengen an Phosphat sind für das Überleben der Zellen erforderlich. In Pflanzen ist Pi für Wachstum und Entwicklung unerlässlich. In Pilzen reguliert der Pi-Signalweg die Expression zahlreicher phosphatreaktiver Gene, die am Scavenging und der Aufnahme von Pi aus extrazellulären Quellen beteiligt sind. Bei Trypanosomatid-Parasiten beeinflusst Pi ihre Fähigkeit, korrekt zu wachsen und sich im wirbellosen Wirt anzusiedeln.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Proteinphosphatasen und -kinasen für die Pi-Homöostase bei der Aufnahme, Speicherung, Freisetzung und metabolischen Integration von Pi notwendig sind. In diesem Beitrag wird die Regulierung von Phosphatasen durch anorganisches Phosphat zusammengefasst, wobei der Schwerpunkt auf der Rolle dieser Enzyme in der Zellbiologie liegt.
2. Feedback-Kontrolle von Phosphatasen durch anorganisches Phosphat: Der PHO-Weg
Saccharomyces cerevisiae besitzt mehrere Phosphatasen mit unterschiedlicher Spezifität, zellulärem Standort und Permeasen, die bei der Pi-Aufnahme verwendet werden. Die Gene, die für diese Aktivitäten verantwortlich sind, werden koordiniert durch die Pi-Konzentration im Wachstumsmedium unterdrückt. Der Erwerb, die Speicherung, die Freisetzung und die metabolische Integration von Pi in der Zelle erfordert die Beteiligung vieler wichtiger Enzyme wie extrazelluläre saure Phosphatasen (APasen), Phosphodiesterasen, Pi-Transporter, Polyphosphatkinasen, alkalische Phosphatasen (ALPasen) und Endopolyphosphatasen . Die Aktivitäten dieser Enzyme sind untrennbar mit der Pi-Homöostase verbunden und werden als Reaktion auf unterschiedliche Pi-Konzentrationen über den Pi-Signaltransduktionsweg (PHO) reguliert.
In einem aktuellen Modell für die PHO-Regulierung ist der positive Regulator (oder positive Faktor) Pho4p, der vom PH04-Gen kodiert wird, durch seine Aktivität und seinen Standort für die transkriptionelle Aktivierung der PHO-Gene unerlässlich. In einem Medium mit hohem Pi-Gehalt hemmt ein Cyclin-abhängiger Kinase (CDK)-Komplex, bestehend aus Pho80p und Pho85p, die Funktion von Pho4p durch Hyperphosphorylierung. Hyperphosphoryliertes Pho4p verbleibt im Zytoplasma und ist nicht in der Lage, die Transkription der PHO-Gene zu aktivieren. Wenn die Pi-Konzentration im Medium ausreichend niedrig ist, hemmt Pho81p die Funktion des Pho80p-Pho85p-Komplexes, so dass sich Pho4p in den Zellkern verlagern und die Transkription der PHO-Gene aktivieren kann. Diese Gene kodieren für die Hochaffinitätstransporter Pho84p und Pho89p, die sekretierten sauren Phosphatasen Pho5p, Pho11p und Pho12p und andere verwandte Proteine, die die Pi-Gewinnung aus extrazellulären Quellen erhöhen.
Dieser PHO-Weg ist in verschiedenen Organismen wie Pflanzen, Bakterien und Pilzen beschrieben worden.
3. Das Phosphatasesystem in Hefe
Anfänglich wurde beobachtet, dass mehrere Phosphatasegene durch die Pi-Konzentration im Kulturmedium moduliert werden; daher wurde der PHO-Weg zunächst durch unterschiedlich exprimierte Phosphatasen charakterisiert.
In S. cerevisiae wird die Transkription von Genen, die für saure und alkalische Phosphatasen und den Pi-Transporter kodieren, in Abhängigkeit von der Pi-Konzentration im Kulturmedium koordiniert unterdrückt und aufgehoben. Die meisten der unter Pi-limitierenden Bedingungen synthetisierten Phosphatasen sind extrazellulär lokalisiert oder mit der Plasmamembran oder der Zellwand assoziiert.
Zu den Pi-regulierten Phosphatase-Genen gehören PHO5, das für die Hauptfraktion der repressiblen sauren Phosphatasen (rAPase; pH-Optimum 3-4; EC 3.1.3.2) kodiert, und seine Isoenzyme PHO10 und PHO11 . Diese drei rAPasen sind Glykoproteine, die sich in der Zellwand oder im periplasmatischen Raum befinden. Sie sind für den Phosphatabbau verantwortlich und arbeiten mit hochaffinen Transportern zusammen, um bei niedriger Pi-Konzentration in der Umgebung Phosphat aufzunehmen. Die durch das PHO5-Gen kodierte rAPase wird während der Sekretion durch die Membran glykosyliert und ist im periplasmatischen Raum lokalisiert. Pho5p ist für >90% der APase-Aktivität verantwortlich.
Da das PHO5-Genprodukt den Großteil der sauren Phosphatasen ausmacht, ist die PHO5-Regulation der Schlüssel zur zellulären Phosphathomöostase. Die Transkriptionsaktivatoren Pho4p und Pho2p sind erforderlich, um die aktive Chromatinstruktur im PHO5-Promotor zu erzeugen und die Transkription zu stimulieren. Pho80p-Pho85p ist ein Cyclin/Cyclin-abhängiger Kinase-Komplex, der Pho4p an mehreren Stellen phosphoryliert und so die Funktion von Pho4p negativ reguliert. Huang und O’Shea führten ein quantitatives enzymatisches Hochdurchsatz-Screening einer Hefe-Deletionssammlung durch und suchten nach neuen Mutanten, bei denen die PHO5-Expression gestört ist. Unter den konstitutiven Mutanten zeigten die pho80- und pho85-Stämme die höchsten Werte der Pho5-Phosphatase-Aktivität und der PHO5-mRNA unter Bedingungen mit hohem Phosphatgehalt, was auf ihre zentrale Rolle im PHO-Weg hindeutet. Der vollständige Verlust der hohen Kinaseaktivität (Pho80p-Pho85) führt zu einer vollständigen Aktivierung des Pho4-Transkriptionsfaktors, was zu einer vollständigen PHO5-Expression führt.
Eine weitere wichtige Klasse von Phosphatasen in S. cerevisiae sind die alkalischen Phosphatasen (ALPase; pH-Optimum 8; EC 3.1.3.1). PHO8 kodiert für eine unspezifische repressible alkalische Phosphatase (rALPase). Es ist ein in der Vakuole lokalisiertes Glykoprotein, das verschiedene Substrate spaltet, um Phosphat aus intrazellulären Produkten zu gewinnen. Pho8p ist ein Mg2+/Zn2+-abhängiges dimeres Protein, ähnlich der ALPase in Escherichia coli und in Säugetierzellen. Das Enzymprodukt von PHO13 ist ein monomeres Protein und ist spezifisch für p-Nitrophenylphosphat (pNPP) und Histidinylphosphat. Dieses Enzym wurde stark durch Mg2+-Ionen aktiviert, mit einem pH-Optimum von 8,2 und einer hohen spezifischen Aktivität für pNPP, mit einem Mittelwert von 3,6 × 10-5 M.
4. Phosphorstress moduliert saure Phosphatasen in Pflanzen
Saure Phosphatasen (APasen) können gegen eine breite Palette von organischen Phosphaten im Boden aktiv sein. Bei diesen Enzymen handelt es sich um unspezifische orthophosphorische Monoesterphosphohydrolasen (EC 3.1.3.2), die Pi von Esterbindungen abspalten. Sekretierte Pflanzenphosphatasen halten 50% Aktivität über einen breiten pH-Bereich (4,0-7,6) aufrecht, behalten 80% Aktivität über einen breiten Temperaturbereich (22°C-48°C) bei und sind bei Temperaturen von bis zu 60°C stabil, was sie zu idealen Kandidaten für aktive Bodenenzyme macht.
APasen sind in Arabidopsis reichlich vorhanden und werden durch mindestens vier Genfamilien repräsentiert. Bei einer kürzlich durchgeführten Untersuchung des annotierten Arabidopsis-Genoms wurden Sequenzen für 1 His-APase, 4 Phosphatid-APasen, 10 vegetative Speicherprotein-APasen und 29 Purpur-APasen identifiziert.
In den letzten Jahren hat es ein erhebliches Interesse an Purpur-APasen (PAPs) gegeben. Die vergleichende Analyse der Struktur von PAPs aus höheren Pflanzen und Säugetieren hat die Identifizierung von konservierten Sequenz- und Strukturmotiven in dieser Art von Enzymen aus vielen eukaryotischen Arten ermöglicht.
Biochemisch gesehen funktionieren Pflanzen-PAPs als homodimere Proteine mit einer Molekularmasse von ~55 kDa pro Monomer, während Säugetier-PAPs typischerweise monomere Proteine mit einer Molekularmasse von ~35 kDa sind. Viele PAPs sind Glykoproteine, die auf den sekretorischen Weg ausgerichtet sind. Bei einem PAP aus Spirodela oligorrhiza wurde festgestellt, dass es mit Glycosylphosphatidylinositol in der Zelle verankert ist. Strukturell haben Pflanzen-PAPs zwei Domänen. Die NH2-Domäne hat keine katalytische Funktion. Die COOH-Domäne enthält das Metallzentrum und ist die katalytische Domäne des Enzyms. Ein anderes PAP aus Lupinus albus enthält möglicherweise eine dritte Domäne an seinem Carboxylterminus, deren Struktur der von Steroldesaturasen ähnelt. Es ist nicht bekannt, wie häufig die beiden letztgenannten Formen der posttranslationalen Modifikation bei PAPs aus anderen Arten vorkommen. PAPs sind Metalloenzyme, die in ihrem aktiven Zentrum einen zweikernigen Metallionenkomplex aufweisen. Ihre charakteristische rosa bis violette Farbe ist auf einen Ladungstransfer durch einen Tyrosin-Rest zurückzuführen, der ein Eisen(III)-Ion koordiniert. Dieses Enzym kann Phosphorsäureester und -anhydride hydrolysieren.
PAPs wurden aus Phaseolus vulgaris (Ackerbohne) , Glycine max (Sojabohne) , Lupinus albus (Weiße Lupine) , Lycopersicon esculentum (Tomate) , Triticum aestivum (Weizen) , Hordeum vulgare (Gerste) , Zea maize (Mais) , und Oryza sativa (Reis) isoliert.
Die Reaktion der Pflanzen auf Pi-Mangel kann in zwei Kategorien unterteilt werden: die spezifische Reaktion und die allgemeine Reaktion. Die spezifischen Reaktionen fördern die effiziente Mobilisierung und Aufnahme von Pi aus dem Wachstumsmedium und den intrazellulären Speichern. Die allgemeinen Reaktionen ermöglichen ein langfristiges Überleben, indem sie den Zellstoffwechsel mit der Verfügbarkeit von Nährstoffen und dem Wachstumspotenzial koordinieren. Die Umsetzung dieser Strategien erfordert Veränderungen in den Expressionsprofilen von Hunderten von Genen, wie die Transkriptomanalysen von Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) zeigen.
Während des Pi-Mangels erhöhen die Pflanzen als allgemeine Reaktion die Phosphatase-Expression. Die Phosphataseproduktion steht in Zusammenhang mit Pi-Mangel, und es wurde eine positive Korrelation zwischen der sauren Phosphataseproduktion und der Pi-Ernährung vorgeschlagen. Zum Beispiel produzieren Pflanzen wie Lupinen, die effizienter bei der Beschaffung von Pi aus dem Boden sind, deutlich mehr Phosphatase im Vergleich zu Getreide .
Wu et al. analysierten die Regulierung von Proteinphosphatasen in Arabidopsis und fanden heraus, dass drei Gene für PAP durch Pi-Mangel induziert wurden. Darüber hinaus wurde das Gen At1g25230 um mehr als das Zweifache induziert, was zeigt, dass dieses Gen auf Pi-Mangel reagiert.
Im Reisgenom wurden insgesamt 26 mutmaßliche PAP-Gene identifiziert, und Pi-Mangel induzierte die Expression von 10 Reis-PAP-Genen, was darauf hindeutet, dass diese eine wichtige Rolle bei der Akklimatisierung von Reis an niedrige Pi-Bedingungen spielen.
In Lycopersicon esculentum (Tomate) wird LePS2 durch Pi-Mangel induziert. Es wird festgestellt, dass die LePS2-Phosphatasen die ersten zytoplasmatischen Phosphatasen sind, die Komponenten der Pi-Mangel-Reaktion sind. Die Suspendierung von Tomatenzellen in einem Pi-mangelnden Medium führte zu einem Anstieg der PAP-spezifischen Aktivität um etwa das Vierfache, während die PAP-spezifische Aktivität in Zellen, die in einem Medium mit hohem Pi-Gehalt gehalten wurden, niedrig und konstant blieb. Der Anstieg der PAP-Aktivität in Zellen, die in einem Medium mit niedrigem Pi-Gehalt wachsen, zeigt, dass PAP eine Rolle bei der Verbesserung der Verfügbarkeit und Nutzung von Pi spielen könnte und möglicherweise entscheidend für die Mobilisierung von intrazellulärem Pi ist, indem es einen Mangel an Pi in der Tomate wahrnimmt.
5. Ectophosphatasen als Pi-Sensoren
Die Plasmamembran von Zellen kann Enzyme enthalten, deren aktive Stellen dem externen Medium und nicht dem Zytoplasma zugewandt sind. Die Aktivitäten dieser Enzyme, die als Ektoenzyme bezeichnet werden, können an intakten Zellen gemessen werden. Ektophosphatasen und Ektokinasen wurden in mehreren Mikroorganismen, einschließlich Protozoen, Bakterien und Pilzen, nachgewiesen.
Viele Studien haben gezeigt, dass Ektophosphatasen eine Rolle beim Erwerb von Pi für das Wachstum verschiedener Zelltypen spielen. In Pilzzellen (Fonsecae pedrosoi) induziert der Entzug von Pi aus dem Kulturmedium offenbar die Expression verschiedener Ektophosphatase-Aktivitäten. Es hat sich gezeigt, dass die Kultivierung dieser Pilze in Abwesenheit von exogenem Pi zur Bildung von Pilzzellen führt, die eine 130-mal höhere Ektophosphatase-Aktivität aufweisen als Pilze, die in Gegenwart von Pi kultiviert werden. Trypanosomatidenzellen verfügen über Ektophosphatasen, die Pi durch Hydrolyse von Phosphomonoester-Metaboliten bereitstellen. Bei T. rangeli beispielsweise induziert eine niedrige Pi-Konzentration im Wachstumsmedium die Expression einer anderen Ektophosphatase-Aktivität, was darauf hindeutet, dass dieses Enzym zur Hydrolyse von phosphorylierten Verbindungen im extrazellulären Medium führt. Diese Hydrolyse könnte zum Erwerb von Pi während der Entwicklung von T. rangeli Epimastigoten beitragen.
Unter Bedingungen der Pi-Limitierung exprimieren fluoreszierende Bakterien Pseudomona eine Reihe von Phosphatmangelgenen. So werden beispielsweise im P. putida-Stamm KT2442 mindestens 56 Pi-Mangelproteine induziert, und im P. fluorescens-Stamm DF57 wurde über die Induktion mehrerer Phosphatmangelgene berichtet.
In vielen Eukaryonten ist die Familie der Nukleotidpyrophosphatase/Phosphodiesterase-Proteine (E-NPP) direkt für die Phosphathydrolyse aus extrazellulären Nukleotiden verantwortlich. NPP1 bis -3 sind in fast allen menschlichen Gewebetypen zu finden, und diese Enzyme enthalten eine alkalische Ektonukleotidpyrophosphatase/Phosphodiesterase-Typ-1-Domäne. In S. cerevisiae werden NPP1 und NPP2 durch Pi-regulierte Transkription hochreguliert.
6. Abschließende Bemerkungen
Pi ist eine Verbindung, die in verschiedenen Organismen wachstumslimitierend wirkt, wenn ihre Verfügbarkeit in vielen Ökosystemen gering ist. Die Induktion von Phosphatase-Aktivität als Reaktion auf Pi-Mangel ist ein häufiges Phänomen bei Organismen, die Pi aus der Umwelt beziehen. Diese Enzyme sind in der Lage, phosphorylierte Substrate zu hydrolysieren, um während eines Nährstoffmangels eine Quelle für Pi zu schaffen. In Saccharomyces cerevisiae löst das Signal des Pi-Mangels eine erhöhte Produktion von mindestens vier Arten von Phosphatasen aus: (1) die sauren Phosphatasen Pho5, Pho11 und Pho12, die im periplasmatischen Raum lokalisiert sind; (2) die alkalische Phosphatase Pho8, die in der Vakuole lokalisiert ist; (3) die Glycerinphosphatase Hor2; (4) die mutmaßliche Polyphosphatase Phm5, die in der Vakuole lokalisiert ist. Alle diese Enzyme können zu einem erhöhten Gehalt an freiem Pi beitragen. Allerdings könnten diesen Enzymen auch andere Funktionen zugeschrieben werden.
Del Pozo et al. reinigten eine saure Phosphatase, AtACP5, die durch Pi-Mangel in Arabidopsis thaliana induziert wird. Dieses Enzym weist zwei Aktivitäten auf: die Hydrolyse phosphorylierter Substrate und die Bildung von Peroxiden. Die Phosphataseaktivität spiegelt wahrscheinlich eine Rolle bei der Pi-Mobilisierung wider; die Peroxidationsaktivität deutet darauf hin, dass AtACP5 auch eine Rolle im Metabolismus reaktiver Sauerstoffspezies spielen könnte.
Zusammengenommen spielen die durch Pi-Mangel induzierten Phosphatasen eine Rolle bei der Anpassung eines Organismus an Stress, obwohl auch andere Rollen gefunden werden können.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch den Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), und Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick und A. L. A. Dos-Santos haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.