Menneskelige deltagere

Forekomster i Spanien blev gennemgået og godkendt af den etiske komité på Universitetshospitalet La Fe Valencia og overholdt principperne i Helsinki-erklæringen og yderligere revisioner. Eksperimenter i Berlin blev godkendt af den etiske komité ved Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA4/012/05). Der blev undersøgt to kohorter: den ene bestod af 65 raske voksne frivillige og den anden af 16 patienter med Ushers syndrom (type II) med forskellige trunkeringsmutationer i USH2A. Data fra tre patienter blev udeladt fra denne undersøgelse på grund af, at to patienter havde en tidligere diagnose af diabetes og en patient med karpaltunnelsyndrom, hvilket kunne påvirke de psykofysiske tærskelværdier. Deltagerne i undersøgelsen blev testet med et batteri bestående af ni psykofysiske test, der blev påført huden. Alle deltagere modtog skriftlig og mundtlig information, inden de deltog i undersøgelsen, og gav deres skriftlige samtykke. Ingen af undersøgelsesdeltagerne var <20 år gammel. Følgende deltageroplysninger blev dokumenteret: alder, køn, håndledighed, høreapparater (høreapparater, cochlear-implantater), sværhedsgrad af døvhedssymptomer og blindhedssymptomer og komorbiditeter.

Human kvantitativ sensorisk testning

Psykofysisk testning blev udført i henhold til den standardiserede testprotokol for kvantitativ sensorisk testning fra det tyske forskningsnetværk for neuropatiske smerter44. Vibrotaktile perceptuelle tærskelværdier ved forskellige frekvenser blev bestemt ved hjælp af en test med to valg1,2. Apparatet bestod af en lineær piezoaktuator (Physik Instrumente, katalognr. P-602.1 L), hvis forskydninger drives og styres af en forstærker/controller (Physik Instrumente, katalognr. E-665). Signalerne blev behandlet af PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments) dataindsamlingssystemet. Vibrationsstimulansen var 1,8 s lang, og stignings- og faldtiden ved start og offset var henholdsvis 500 og 600 ms, uafhængigt af testfrekvens eller amplitude. Stimulusens varighed mellem on- og offsetfaserne var 700 ms. Der blev anvendt et sæt vibrationsstimuli, som var logaritmisk skaleret mellem 18 nm og 45 μm. For 10-Hz- og 125-Hz-vibrationsprøverne blev startamplituden sat til henholdsvis 7,18 μm og 2,84 μm. Vi målte ikke direkte sondens bevægelse under de anvendte testbetingelser. Denne piezoaktuator viser høj nøjagtighed, men der kan teoretisk set forekomme amplitudedæmpning ved forskydninger med større amplitude i nærheden af aktuatorens maksimale bevægelsesamplitude (35 µm). Alle deltagere viste imidlertid psykofysiske tærskler langt under 35 µm for alle de testede frekvenser (fig. 1c). Bemærk, at nøjagtig det samme apparat blev anvendt til måling hos raske kontroller og deltagere med Usher’s syndrom. Mekaniske vibrationsstimuli blev leveret til huden mellem neglebækkenet og første led på lillefingeren. Sonden var fremstillet af glas og havde et fladt, cirkulært kontaktområde med en diameter på 5 mm og et fladt, cirkulært kontaktområde med en modvægt af messing for at sikre, at der blev anvendt den samme grad af holdekraft hos hver deltager. Lillefingeren på den dominerende hånd blev testet over to frekvenser (10 Hz og 125 Hz; varighed på 1,8 s). Deltagerne signalerede, at de havde registreret en vibrerende stimulus i et af to tidsvinduer ved at trykke på en knap. Protokollen bestod af et op-ned-design, der øgede eller mindskede stimulusens amplitude (mellem 18 nm og 45 µm), afhængigt af succesraten under opgaven. Der blev udført otte op- og nedadgående amplitudeomvendinger (i alt ~40-80 individuelle forsøg pr. session) omkring den perceptuelle tærskel for at skabe en gennemsnitlig perceptuel tærskel for hver patient. Amplituden af de vibrationsstimuli, der blev drevet af piezoenheden, blev kalibreret ved at måle sondens forskydningsamplitude under et mikroskop til trinvise spændingsinkrementer.

Der blev også anvendt en taktil skarphedstest til at teste grænserne for den rumlige opløsning af fingerspidsen (medianinnervation) ved hjælp af en to-interval, tvunget valg, taktil gitterorienteringstest med en taktil skarphedskube, som bestod af seks sider med gitre af forskellige bredder (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 og 6,0 mm)1,2,3. Deltagerne havde bind for øjnene, og terningen blev placeret i lodret eller vandret retning mod deres fingerspids. Der blev anvendt en to ned- og en op-procedure med 10-15 omdrejningspunkter for gitterstørrelse. Tærskelværdierne (71 % korrekt svar) blev beregnet som medianen af de sidste 10 ud af 15 vendepunkter2. Mekaniske detektionstærskler blev bestemt ved hjælp af et standardiseret sæt af 23 vFh-filamenter (Optihair3-Set) med kræfter på mellem 0,25 og 265 mN. VFhs blev påført i en stigende rækkefølge på den dorsale side af hånden (radial innervation) i 1 s, indtil deltageren opfattede en taktil fornemmelse. Rækkefølgen blev derefter omvendt indtil det punkt, hvor deltageren ikke opfattede en taktil fornemmelse. Den gennemsnitlige kraft af fem omvendinger blev taget som tærskelværdi. Mekaniske smertetærskler blev testet med et sæt af syv vægtede pinprick-stimulatorer (MRC Systems) med spidser på 0,25 mm og kræfter på mellem 8 og 512 mN. Der blev udført en simpel trappemetode (en op- og en ned-regel), hvor patienterne blev spurgt, om stimulus blev opfattet som skarphed, der forårsagede følelsen af prikkende smerte. Stimuli blev påført på den dorsale side af hånden efter vFh-detektionsopgaver. Tærsklen blev beregnet ud fra gennemsnittet af fem omvendinger. Tærskelværdierne for termisk varm og kold perception og tærskelværdierne for varm og kold smerte blev testet ved hjælp af en TSA II termosensorisk analysator (MEDOC). Termodioden havde et areal på 9 cm2 , cut-off-temperaturer mellem 0 og 50 °C og en temperaturændringshastighed på 1 °C s-1. Termoden blev anbragt på den volare side af den midterste del af forarmen (medial antebrachial innervation). Der blev udført tre på hinanden følgende forsøg for hver termisk test i følgende rækkefølge: kolddetektion, varmdetektion og kold smertetærskel og varm smertetærskel. Deltagerne i undersøgelsen blev bedt om at angive, på hvilket tidspunkt de begyndte at opleve afkøling, opvarmning, kulde- og varmesmerter. Tærskelværdierne var den gennemsnitlige temperatur for de tre forsøg i hver test.

Mus

Alle forsøg blev godkendt af Berlins dyreetiske komité (Landesamt für Gesundheit und Soziales) og udført i overensstemmelse med europæisk dyrevelfærdslovgivning. Der blev anvendt han- og hunmus Ush2a-/–mus og wild-type kuldkammerater (Ush2a+/+) fra CBA/CaJ-baggrunden i alderen mellem 10 og 30 uger11. Alle anatomiske og elektrofysiologiske eksperimenter blev udført på omtrent lige mange hun- og hanmus. Til vibrationsdetektionsopgaven blev der kun anvendt hunmus. Alle mus blev holdt på en 12 timers lys:12 timers mørkecyklus.

Musvævets anatomi og immunohistokemi

Til immunohistokemi af huden blev musene euthaniseret ved CO2-inhalation i 2-4 minutter efterfulgt af cervikal dislokation, og potehudvævet blev dissekeret og hypodermis, ligamenter og tilknyttet muskelvæv fjernet. Hudprøverne blev strakt ud med insektnåle og fikseret i 45 minutter i 4 % paraformaldehyd (PFA). Til gelatinevibratomsnit blev vævsprøverne anbragt i indlejringsforme (Polysciences, T-8), fyldt med varm gelatine (20 %, opløst i 0,1 M fosfatbufferet saltvand (PBS)) og postfikseret i 4 % PFA natten over ved 4 °C, før der blev skåret 120 µm-snit med et vibratom (Leica, VT100S). Til farvning af helmontering blev hudprøverne strækket i 2 timer i PFA og derefter postfikseret ved 4 °C i 24 timer i 20 % dimethylsulfoxid og 80 % methanol. Efter opskæring eller postfiksering blev vævsprøverne vasket tre gange i PBS (0,1 M) og inkuberet i 72 timer ved 4 °C i blokeringsopløsning og primære antistoffer. Prøverne blev derefter vasket tre gange i PBS, inden de blev inkuberet i 24 timer (4 °C) med sekundære antistoffer fortyndet i blokeringsopløsning. Vævet blev derefter igen vasket tre gange og behandlet med henblik på vævsopklaring ved hjælp af 2,2′-thiodiethanol (TDE, Sigma-Aldrich). Sektionerne blev anbragt i stigende koncentrationer af TDE hver 2. time, fra 10 % til 25 %, 50 % og 97 %, hvori prøverne blev opbevaret og monteret på objektglas og dækglas.

Polyklonale antistoffer, der er rettet mod Ush2A, blev fremstillet i kanin af Eurogentec. Der blev fremstillet fire antistoffer, der binder til forskellige bindingsepitoper på N- og C-terminalerne af Ush2A (N-terminus: antistof 1, CSPLYNDKPFRSGDNV og antistof 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-terminus: antistof 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR og antistof 2, CIRERPPLVPLQKRMT), og de blev renset fra antiserum før brug. Alle fire antistoffer blev anvendt sammen (1:200) til farvningsprotokoller i sekventielle farvninger med kylling anti-NF200 (Millipore, 1:1.000), kanin anti-S100 (Dako, 1:1.000) eller marsvin anti-CK20 (Origene Tech, 1:200). Der blev anvendt sekundære antistoffer mod kanin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), mod kylling Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800), mod mus Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), mod kanin Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) og mod marsvin Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Der blev taget z-stack-billeder ved hjælp af et konfokalt mikroskop (Carl-Zeiss, katalognummer LSM700) med Zen2009-software. NF200+ og S100+ nervefiber-innerverende Meissners korpuskler og hårfollikler blev visualiseret og talt ved hjælp af Fiji/ImageJ. Til elektronmikroskopibilleder af iskiasnerven blev dyrene perfunderet, og iskiasnerven blev dissekeret og fikseret i 4 % PFA og 2,5 % glutaraldehyd og kontrasteret med osmiumtetroxid, inden den blev indlejret i Technovit 7100-harpiks (Heraeus Kulzer). Ultratynde snit blev optaget ved 5 600× forstørrelse. Myeliniserede nervefibre og umyeliniserede fibre blev talt og målt ved hjælp af Fiji/ImageJ-software.

Reproducerbarhed

Alle immunohistokemiske eksperimenter og billeder, der blev optaget, blev gentaget i flere kohorter af mus på forskellige dage, og der blev ikke taget billeder fra enkelte individer, som ikke kunne reproduceres. Elektronmikroskopibilleder blev taget fra forskellige kuldbørn i en enkelt eksperimentel kørsel.

Mus hud-nervepræparat og sensoriske afferente optagelser

Kutane sensoriske fiberoptagelser blev udført ved hjælp af ex vivo-hud-nervepræparatet. Musene blev aflivet ved CO2-inhalation i 2-4 minutter efterfulgt af en dislokation af livmoderhalsen. Der blev udført tre forskellige præparater i separate forsøg med forskellige poteregioner: Nervus saphenus innerverer den behårede hud på bagpoden21; nervus tibialis innerverer den glatte hud på bagpoden; og nervus medialis og nervus ulnaris innerverer den glatte hud på forpoden20. I alle præparater blev den behårede hud på lemmet barberet, og huden og nerven blev dissekeret fri og overført til registreringskammeret, hvor muskel-, knogle- og senevæv blev fjernet fra huden for at forbedre registreringskvaliteten. Optagelseskammeret blev perfunderet med en 32 °C syntetisk interstitiel væske: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM natriumgluconat, 5,5 mM glukose, 7,5 mM saccharose og 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsyre (Hepes), pH 7,4. Huden blev pillet ud og strakt, således at hudens yderside kunne stimuleres ved hjælp af stimulatorsonderne. Den perifere nerve blev ført igennem til et tilstødende kammer i mineralolie, hvor fine filamenter blev revet ud af nerven og anbragt på en sølvtrådsoptagelseselektrode.

De enkelte mekanoreceptorers receptive felter blev identificeret ved mekanisk at sondere hudens overflade med en stump glasstav eller en stump pincet. Analogt output fra en Neurolog-forstærker blev filtreret og digitaliseret ved hjælp af Powerlab 4/30-systemet og Labchart 7.1-software (ADinstruments). Spike-histogram-udvidelsen til Labchart 7.1 blev brugt til at sortere spikes fra individuelle enheder. Elektriske stimuli (1 Hz, kvadratiske pulser på 50-500 ms) blev leveret til receptive felter for enkelt-enheder for at måle ledningshastigheden og muliggøre klassificering som C-fibre (hastighed <1,2 m s-1), Aδ-fibre (1,2-10 m s-1) eller Aβ-fibre (>10 m s-1). Mekanisk stimulering af neuronernes receptive felter blev udført ved hjælp af en piezoaktuator (Physik Instrumente, katalognr. P-841.60) og en Nanomotor med dobbelt ende (Kleindiek Nanotechnik, katalognr. MM-NM3108) forbundet med en kraftmålingsanordning (Kleindiek Nanotechnik, katalognr. PL-FMS-LS). Kalibrerede kraftmålinger blev erhvervet samtidigt ved hjælp af Powerlab-systemet og Labchart-softwaren under eksperimentet (Extended Data Fig. 10).

Da forskellige fibertyper har forskellige stimulus-tuning egenskaber, blev der anvendt forskellige protokoller for mekaniske stimuli baseret på enhedstypen. Aβ-fibre med lav tærskel (RAM’er og SAM’er) og Aδ-fiber D-hår blev stimuleret med piezoaktuatoren med tre vibrationsstimuli (5 Hz, 25 Hz og 50 Hz, forvrængninger indført af in-series kraftsensoren udelukkede brug af frekvenser >50 Hz) med stigende amplitude over seks trin (peak-to-peak-amplituder på ~6-65 mN; 20 cyklusser pr. trin), og en dynamisk stimulussekvens med fire ramp-and-hold-bølgeformer med varierende sondeafbøjningshastigheder (3 s varighed; 0.075, 0,15, 0,45 og 1,5 mm s-1; gennemsnitlig amplitude 100 mN). Aβ-fiber SAM’er og RAM’er blev klassificeret efter tilstedeværelsen eller fraværet af affyring under henholdsvis den statiske fase af en rampe-og-hold-stimulus som tidligere beskrevet20,21. Enkeltstående enheder blev desuden stimuleret med en serie af fem statiske mekaniske stimuli med rampe-og-hold-bølgeformer med stigende amplitude (3 s varighed; varierende fra ~10 mN til 260 mN). SAM’er med lav tærskelværdi, Aδ-fibre med høj tærskelværdi og C-fibre blev også stimuleret ved hjælp af nanomotoren med fem rampe-og-hold-stimuli med stigende amplituder20.

Enkle-enhedsoptagelser fra Pacinian afferenter

For at vurdere mekanosensitiviteten af Pacinian corpuscles placeret omkring fibula blev huden og alle muskler fjernet fra underbenet, og den interosseøse nerve blev dissekeret fri fra den interosseøse membran. Derefter blev fibula og tibia, som hos mus er smeltet sammen langs deres distale halvdel, fjernet fra dyret sammen med den interosseøse nerve og blev overført til et tilpasset organbadkammer, hvor de blev monteret ved hjælp af en tilpasset mini-vice. Hele dissektionsproceduren blev udført i iskold dissektionsbuffer, der indeholdt 108 mM N-methyl-d-glukamin, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM natriumgluconat, 5,5 mM glucose, 18,5 mM saccharose og 0,5 mM CaCl2 (justeret til pH 7,4 med NaOH). Efter en restitutionsperiode på 10 minutter blev præparatet perfunderet med oxygeneret optagelsesbuffer (35 °C), som bestod af 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM natriumgluconat, 5,5 mM glucose, 7,5 mM saccharose og 1,5 mM CaCl2 (justeret til pH 7,4 med NaOH), og den proximale ende af den interosseøse nerve blev overført til et oliefyldt registreringskammer ved at føre den gennem et lille hul (~1 mm i diameter), der forbandt organbadkammeret med det tilstødende registreringskammer. Efter fjernelse af perineurium blev de enkelte filamenter dissekeret fri og fastgjort til optagelseselektroden med henblik på registrering af aktionspotentiale. Optagelserne blev foretaget med Neurolog-systemet (Digitimer Ltd, katalog nr. NL100AK og NL104A) og et PowerLab 4SP, der blev styret af LabChart 7.1 (AD Instruments). For at bestemme den mekaniske aktiveringstærskel og frekvensafstemningen af pacinianske afferenter blev der påført en række sinusformede mekaniske stimuli (varighed 1 s; lineært stigende amplitude damp/dt = 30 µm s-1; maksimal amplitude 30 µm) med stigende frekvenser (40-480 Hz) på den distale ende af fibula med en metalstang (spidsdiameter 1 mm), der var fastgjort til en piezoaktuator (Physik Instrumente GmbH, katalognr. P-840.2).

Læringsopgave med vibrationsopfattelse hos mus

Først blev musene med henblik på implantation af hovedstøtten bedøvet med isofluran (1,5-2 % i O2) og injiceret subkutant med metamizol (200 mg pr. kg kropsvægt). En letmetalstøtte blev implanteret på kraniet med lim (UHU dent) og tandcement (Paladur). Musenes temperatur blev overvåget med en rektal sonde og holdt på 37 °C ved hjælp af en varmepude. Musene blev derefter anbragt i deres hjemmebur med metamizol (200 mg ml-1) i drikkevandet. De implanterede mus blev vænnet til at blive fastholdt i hovedet 3-5 d efter operationen. Musene blev gradvist vænnet til hovedfiksering i den adfærdsmæssige opsætning. Derefter, 1 d efter starten af vandrestriktion, gennemgik musene to parringssessioner på på hinanden følgende dage.

Under parringssessionerne (30- til 45 minutters varighed) blev der givet vandbelønninger fra en vandudløb parret med præsentation af vibrationsstimulus (3 s varighed, 5 Hz, 60 mN) til den glatte hud på forpoden for at opbygge en association mellem stimulus og belønning. Vibrationsstimulansen blev givet til poten via en skræddersyet, dæmpet glasstang på 2 mm2 , der var fastgjort til en piezoaktuator (PICMA fra Physik Instrumente, katalognr. PL127.11). Et spændings-kraftforhold blev kalibreret ved hjælp af et kraftmålingssystem (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) til måling af den anvendte sinusformede kraftprofil, der blev anvendt af piezoenheden efter hvert forsøg. Den anvendte bøjningspiezoaktuator kan have tilføjet en vis harmonisk støj sammenlignet med andre stablede piezosystemer. Kalibrering af piezoen i hvert eksperiment sikrede imidlertid, at de betydelige underskud i taktil opfattelse af Ush2a-deficiente mus sandsynligvis ikke var et teknisk artefakt.

Efter parring begyndte daglige træningssessioner, hvor musene modtog en lille vandbelønning (4-7 μl) fra tuden, når de slikkede korrekt i løbet af et vindue af muligheder i starten af stimulus (3,5 s). Fangstforsøg, hvor der ikke blev præsenteret nogen stimulus, og hvor slikkene blev talt som falske alarmer, blev interleaved som 50% af de samlede forsøg. Forsøg blev ikke signaleret af nogen ekstern begivenhed eller stimulus som tidligere beskrevet10 og blev leveret med randomiserede tidsintervaller mellem 3 og 30 s. Hvis musene slikkede i løbet af et vindue på 2 s før stimulusstart, blev der pålagt en forsinkelse på 3 til 30 s for at fremme stimulus-vandbelønningsassociation. En træningssession bestod af ca. 60 forsøg (30× stimulus + 30× fangst). Hits og falske alarmer blev sammenlignet for at vurdere præstationen under træningssessionerne. For at teste, at musene slikkede som reaktion på vibrationsstimulansen på forpoden, blev der i slutningen af træningen inkluderet en session, hvor den stimulerende anordning blev flyttet 3-5 mm under poten, så der ikke blev skabt hudkontakt. I de efterfølgende forsøgsdage, efter at musene havde lært opgaven med succes, blev der givet vibrationsstimuli med forskellige amplituder og frekvenser. For 5 Hz-vibrationer blev der anvendt kræfter på 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN og 6 mN til at stimulere forpoden, med to forskellige amplituder, der blev vekslet med fangforsøg i løbet af hver dag. F.eks. blev 48-mN- og 24-mN-stimuli og fangforsøg vekslet i løbet af en session, som bestod af ca. 100 forsøg (33× 48-mN-stimuli + 33× 24-mN-stimuli + 34× fangforsøg). 6-mN-stimuli blev testet over to sessioner. For 25-Hz- og 125-Hz-vibrationer blev 60-mN- og 12-mN-kræfter med samme frekvens interleaved med fangforsøg på samme måde over to testsessioner.

Mus parret impulsinhiberingsadfærdstest

Den startle respons hos mus blev vurderet ved hjælp af Startle Response-systemet (SR-LAB, San Diego Instruments). Mus blev vænnet til apparatet i 30 min hver dag i 30 min i 3 d før testning. Kort fortalt blev musenes startle-responser målt over i alt 48 pulse-alone forsøg45 (40 ms varighed, 129 dB) og prepulse + pulse forsøg (20 ms prepulse på 69, 73 eller 81 dB). Præimpulsforsøg var 200 ms før pulsforsøg. Den procentvise parrede-pulsinhibering (% PPI) for hver præpulsintensitet blev beregnet som %PPI = 100 × ((puls alene) – (præpuls + puls))/puls alene.

Mus vFh- og børsteadfærdsforsøg

Mus blev vænnet til testmiljøet i 30 min hver dag i 3 d før testen. På forsøgsdagene blev musene anbragt i individuelle plexiglaskabiner på en forhøjet netplatform. Til penselforsøget blev venstre bagpote strøget fra hæl til tå med en 2 mm hovedpensel 10× med tilfældige intervaller. Procentdelen af tilbagetrækninger blev beregnet. På de efterfølgende testdage blev mekaniske nocifensive tilbagetrækningstærskler målt ved hjælp af vFhs. Kort fortalt blev venstre bagpouls plantarflader stimuleret med vFh-filamenter, og reflextærsklen blev bestemt ved hjælp af op-ned-metoden46. Afhængigt af dyrets reaktion blev der påført vFhs med højere eller lavere kraft på bagpoden for at etablere en serie på seks til ni positive eller negative reflekstiltrækninger. Dette reaktionsmønster blev derefter konverteret, således at dataene udtrykkes som logaritmen af gennemsnittet af tærsklen for 50 % reflekstilbagetrækning46.

Dataanalyse af psykofysiske data fra mennesker

Dataene blev testet for normalitet, og forskelle i psykofysisk præstation for hver test mellem kontroldeltagere og patienter med Usher’s syndrom blev sammenlignet ved hjælp af uparrede Student’s t-tests eller Mann-Whitney U-tests. Z-transformationer blev anvendt til at sammenligne enkelte individuelle dataprofiler med den sunde kontrols middelværdi og s.d.. Z-scoren blev beregnet ved hjælp af Excel-regneark baseret på formlen z = (patientscore – gruppemiddelværdi pr. s.d. af gruppemiddelværdien). z-værdierne >0 indikerer funktionsforøgelse, hvilket betyder, at deltageren er mere følsom over for de testede stimuli sammenlignet med raske kontroller. Individuelle z-scores, der ligger uden for 95 % konfidensintervallet (dvs. z-score <1,96 eller >1,96 s.d.) for datasættet for den sunde kontrol, kan identificeres. Ydelsen i hver test blev testet i parvise sammenligninger ved hjælp af Mann-Whitney U-test, og vi betragtede P < 0,01 som statistisk signifikant.

Dataanalyse af musens vibrationsadfærd

Licks blev registreret med en sensor på spidsen af vandbelønningstudsen. I stimulusforsøg blev et hit talt, når der var et slik inden for det givne tidsvindue (3,5 s) efter stimulusens start. Adfærdsdata blev indsamlet ved hjælp af tilpassede rutiner i Lab View med en samplingfrekvens på 1 kHz, og tilpassede Python-scripts blev anvendt til analyse. Under fangstforsøg fandt der en falsk alarm sted, når der var et slik i løbet af et lige så langt vindue af muligheder. For at vurdere, om musene med succes lærte detektionsopgaven, blev hitrater sammenlignet med falsk alarmrater inden for den samme træningssession ved hjælp af tovejs gentagen variansanalyse (ANOVA) med Bonferronis post-hoc testning.

For at kvantificere præstationen i detektionsopgaverne brugte vi d’ (følsomhedsindeks) i stedet for procentdelen af korrekte forsøg for at tage højde for bias i slikkekriterierne47. Til beregning af d’ blev følgende formel anvendt: d’ = z(h) – z(fa), hvor z(h) og z(fa) er den normale inverse af den kumulative fordelingsfunktion for hhv. hit- og falsk-alarmeringsraternes kumulative fordeling. For at undgå uendelige d’-værdier, når alle forsøg blev rapporteret (rate = 1) eller ingen blev rapporteret (rate = 0), blev raterne erstattet med henholdsvis (1½N) eller (½ N), hvor N er antallet af forsøg, hvor stimulus blev præsenteret48. Z-scorerne for hit- og falske alarmrater blev beregnet ved hjælp af OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) med funktionen NORMINV. Vi har kun udført statistiske test på data, hvor mindst en af genotyperne viser d’ > 1,0, hvilket indikerer, at disse mus rapporterede stimulus. Adfærdsdata blev indsamlet ved hjælp af tilpassede rutiner i Lab View med en samplingfrekvens på 1 kHz, og der blev anvendt tilpassede Python-scripts til analyse. De tilpassede koder og scripts er tilgængelige på anmodning; flere oplysninger er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er forbundet med dette manuskript.

Slikadfærd blev beregnet og plottet som slik sandsynlighed, første slikfrekvens (Hz) eller gennemsnitlig første slik latenstid (s). Disse foranstaltninger blev beregnet som følger: Slik-sandsynlighed er sandsynligheden for, at en mus slikker mindst én gang i løbet af muligheden i et stimulus- eller fangstforsøg (forsøg med mindst 1 slik/samlet forsøg). I PSTH’erne for første slikkeforsøg viser vi den inddelte fordeling af latenserne for de første slikkeforsøg i stimulus- eller fangforsøg. For at normalisere disse data på tværs af musene dividerede vi antallet af første slikkeforsøg med det samlede antal forsøg. Ved at dividere værdien af første slik med binbredden beregnede vi værdien i hertz (slik pr. s). Den gennemsnitlige første sliklatens (s) blev beregnet ved at lægge latenserne for det første slik i hvert hitforsøg sammen og dividere med det samlede antal forsøg.

Dataanalyse af hud-nervepræparationsoptagelser

Kutane forpote- og bagpoteenheder blev kategoriseret på baggrund af deres ledningshastighed og reaktioner på mekaniske stimuli. Mekaniske tærskler for enheder blev beregnet som den temperatur eller mekaniske amplitude, der kræves for at fremkalde det første aktionspotentiale. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 6.0 og Python. Statistiske test omfatter tovejs-ANOVA’er med gentagne foranstaltninger med Bonferronis post-hoc-test, Student’s t-test, Mann-Whitney U-test og Wilcoxons matchede par-test. Kolmogorov-Smirnov-tests blev anvendt til at vurdere dataenes normalitet. Asteriskerne i figurerne angiver statistisk signifikans: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Dataanalyse af elektronmikroskopi af musenerver

Til analyse af elektronmikrografer af iskiasnerven hos musenerver blev antallet af myeliniserede og umyeliniserede fibre talt i 12 sektioner pr. nerve. Det samlede antal fibre pr. nerve blev derefter ekstrapoleret ud fra tværsnitsarealet af hver nerve.

Rapporteringsresumé

Der findes yderligere oplysninger om forskningsdesign i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.