15. februar 2010 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Enkle trin til vellykket bioluminescensbilleder af dyr

Luciferin er det grundlæggende substrat i bioluminescensanalyser. Bioluminescens er baseret på en simpel reaktion, hvor ATP giver brændstof til luciferase-katalysen af luciferin fra ildfluer (biller) til at producere lys, og bioluminescens har brede anvendelsesmuligheder. Dens anvendelse som indikator for biomasse gør det muligt at påvise mikroorganismer i forbrugerprodukter, overflader i produktionsanlæg og er endda blevet anvendt til at afgøre, om der findes liv på månen og Mars.

Bioluminescens anvendes til in vitro- og in vivo-overvågning af biologiske processer, herunder genekspression og protein-protein-interaktioner. Luciferin anvendes f.eks. i reportergenanalyser til undersøgelse af genregulering og -funktion, hvor ekspression af den luciferinmærkede reporter er en markør, der indikerer, at det pågældende gen er blevet optaget i rekombinante DNA-teknikker. Som detektionsreagens anvendes luciferin-luciferase-reaktionen i pyrosequencing til at opnå hurtig detektion af baser i nutidens højtydende DNA-sekventeringssystemer.

For nylig har bioluminescensafbildning vist sig at være en effektiv teknik til direkte undersøgelse af forskellige cellepopulationer i levende smådyr som f.eks. mus. I denne teknik er celler (f.eks. kræftceller, stamceller, T-celler) konstrueret til at udtrykke luciferase og lyse op. Ikke-invasiv visualisering i levende dyr ved hjælp af et følsomt ladningskoblingskamera gør det således muligt at observere sygdomsprogression og -regression i realtid på forskellige tidspunkter i løbet af den terapeutiske behandling. Denne teknik, der anvendes til at forstå det molekylære grundlag for patologier som neurodegenerative lidelser, hjerte-kar-sygdomme, fedme og kræft, er af enorm værdi for klinisk, diagnostisk og lægemiddeludvikling.

Videnskabsfolk hos Regis Technologies har identificeret almindelige svagheder i luciferase-assays. Problemerne opstår ofte, før assayet begynder. Firefly luciferin er et følsomt molekyle, og selv velplanlagte eksperimenter kan give fejlagtige resultater, hvis luciferinen håndteres forkert og beskadiges før brug. I denne artikel beskriver vi det optimale salt, renhed, håndtering og opbevaring af luciferin for at sikre vellykkede og konsistente resultater i billeddannelse af dyr og andre assays.

Købsmæssige overvejelser

Forskere spekulerer ofte på, hvilken form for luciferin de skal bruge. Kalium- og natriumsaltene af luciferin anvendes normalt i flæng. Molekylets opløselighed er imidlertid en vigtig faktor, der skal tages i betragtning i forbindelse med nogle assays. Natriumsaltet er mere opløseligt i vand (>100 mg/mL) end kaliumsaltet (55 mg/mL). Den frie syreform er ganske vist stadig tilgængelig, men anvendes ikke ofte på grund af dens vanskelige opløselighed.

Da nogle få urenheder kan påvirke eksperimenterne på forskellige måder, kan reagensets oprindelige renhed være en vigtig overvejelse.

L-luciferin, en enantiomer af D-luciferin (figur 1), er en kendt urenhed i syntetisk luciferin. Selv om det er påvist, at den fungerer i luciferase-reaktioner, vil der sandsynligvis forekomme en betydelig forskydning i den maksimale lysemission, afhængigt af de anvendte dataindsamlingsparametre. L-luciferin kan let detekteres og kvantificeres ved hjælp af chiral HPLC og bør angives på producentens analysecertifikat. Det meste luciferin bør indeholde mindre end 0,5 % L-luciferin, selv om højere grænser sandsynligvis kan tolereres, så længe L-luciferinniveauerne forbliver konstante under hele forsøget.

Dehydroluciferin (figur 1) er en urenhed, der virker som en inhibitor af luciferase og undertrykker blitzhøjden og den samlede integration. En prøve, der er doteret med 1 % dehydroluciferin, viser mindre end halvdelen af flashhøjden og mindre end 25 % af den samlede integration i løbet af 15 minutter. Dehydroluciferin kan dannes under syntesen eller opbevaringen af luciferin. Valg af en producent, der leverer lave niveauer af dehydroluciferin, vil bidrage til at sikre pålidelige og gentagelige resultater.

Flere almindelige sporforureninger fra syntesen af luciferin kan hæmme andre enzymer i komplekse systemer og kan forårsage eksperimentel variabilitet på grund af forskelle fra batch til batch eller fra producent til producent.

Figur 1. Strukturel sammenligning af D-luciferin og urenheder

Lagring

Firefly-luciferin er følsomt over for lys, ilt og fugt og skal beskyttes. Lys og ilt kan katalysere oxidationen af luciferin til dehydroluciferin. Hvis luciferin efterlades i en ravfarvet flaske under nitrogen ved stuetemperatur, vil det begynde at blive nedbrudt til dehydroluciferin efter en måned (figur 2), men er stabilt i en uåbnet flaske i mindst to år i en fryser. Opløst i vand med tilstrækkelig ilt vil luciferin blive omdannet til dehydroluciferin på kun få dage.

Luciferin bør købes og opbevares i så lille mængde som muligt for at forhindre nedbrydning til dehydroluciferin ved gentagne fryse-optø-åbningscyklusser. Hvis luciferinreagenset købes i løs vægt, kan det være med til at sikre stabiliteten ved at opdele det i ravfarvede ampuller til engangsbrug. Langtidsopbevaring som en frossen opløsning anbefales ikke til følsomme anvendelser som f.eks. undersøgelser af hele dyr. For at hjælpe med at bremse nedbrydningen i frosne opløsninger skal opløsningen spartles med nitrogen eller argon før nedfrysning.

Figur 2. Luciferin-nedbrydning til dehydroluciferin over tid ved 25ºC og -20ºC

Håndtering

Når luciferinflasken åbnes, skal den have lov til at komme helt op på stuetemperatur og derefter spules med nitrogen eller argon, inden den lukkes igen. Hvis luciferinopløsningerne skal anvendes inden for få timer, er der kun få forholdsregler nødvendige. Opløsninger, der skal bruges i løbet af et døgn, skal spares med nitrogen eller argon. Opløsninger bør ikke anvendes i flere dage, da der vil forekomme dehydroluciferindannelse.

Scott B. Mohler ([email protected]) er produktchef hos Regis Technologies. Websted: www.registech.com.