Vores viden om skumcellers oprindelse og cellulære identitet in vivo er påfaldende begrænset i betragtning af disse cellers allestedsnærværende karakter i aterosklerotiske læsioner og deres kritiske rolle i læsionspatogenese, herunder de sene kliniske konsekvenser såsom myokardieinfarkt eller slagtilfælde. I humanpatologiske undersøgelser af avancerede læsioner1 blev skumceller eller lipidrige celler først identificeret som makrofager ved hjælp af monoklonale antistoffer mod CD68, CD45 og HLA klasse II (cluster of differentiation 68, cluster of differentiation 45 og humant leukocytantigen klasse II).2 Disse blev imidlertid hurtigt efterfulgt af undersøgelser med forbedrede aktin-antistoffer, der rapporterede, at glatte muskelceller (SMC) også kunne give anledning til skumceller, både i avancerede og tidlige menneskelige læsioner.3,4 Nylige lineage tracing-undersøgelser foretaget af vores laboratorium5-7 og andre8 har imidlertid vist, at det ikke er en pålidelig metode at anvende markørgener alene til at tildele celleoprindelse i forbindelse med en aterosklerotisk læsion. Det er faktisk blevet vist, at SMC kan miste deres kontraktile markører og udtrykke makrofagmarkører som CD68,5 endothelceller og makrofager kan gennemgå mesenkymal overgang og udtrykke SMC-markører,9-11 og nogle celler i humane læsioner udtrykker både CD68 og ACTA2 (alfa 2-actin), hvilket yderligere forvirrer vores forståelse af skumcellers oprindelse i læsioner.5,12

Se ledsagende artikel på side 876

I dette nummer af Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology giver Wang et al.13 spændende beviser for, at 60 % til 70 % af skumcellerne i åreforkalkningslæsioner hos mus er af SMC- og ikke leukocytoprindelse. Det er vigtigt, at konklusionerne er baseret på en imponerende brug af komplementære metoder, herunder SMC lineage tracing-mus, specialiserede flowcytometriske metoder, der bevarer skumceller af både leukocyt- og ikke-leukocytoprindelse, og påvisning af, at SMC-afledte skumceller synes at være negative for den panleukocytmarkør CD45. Sidstnævnte observation er vigtig, fordi samme gruppe tidligere har påvist, at >50% af skumcellerne i humane avancerede koronararterielæsioner er ACTA2+ CD68+ men CD45-, hvilket tyder på, at ikke-leukocyt-afledte celler også er den vigtigste kilde til skumceller i humane læsioner, og ikke monocyt-makrofager, som man længe har antaget.14,15 Selv om musedataene synes overbevisende, er fortolkningen af de humane data fortsat kontroversiel, fordi den er fuldstændig afhængig af den ubeviste antagelse, at alle leukocyt-afledte skumceller i humane læsioner bevarer ekspression af CD45. En yderligere begrænsning er den manglende mulighed for at foretage streng lineage tracing i undersøgelser på mennesker. Vores laboratorium har tidligere udviklet en epigenetisk metode, der gør det muligt at påvise SMC-afledte celler baseret på på påvisning af H3K4diMe (dimethylering af lysin 4 på histon 3) i Myh11-promotorregionen (myosin heavy chain 11) i histologiske snit.6 Denne metode vil imidlertid have begrænset nytteværdi til analyse af skumceller, fordi det, som Wang et al. anfører, er praktisk talt umuligt at skelne individuelle skumceller i avancerede læsioner. Så hvordan kan disse iboende begrænsninger løses?

Vi mener, at løsningen vil blive fundet baseret på uvildige single-cell RNAseq-analyser (scRNAseq) af avancerede menneskelige læsioner kombineret med komplementære scRNAseq-, flowcytometriske og massecytometriske (CyTOF) undersøgelser af avancerede læsioner fra SMC-lineage tracing atherosklerotiske mus. Selv om der for nylig har været en række scRNAseq-undersøgelser af aterosklerotiske læsioner, mener vi indtil videre, at disse har haft store begrænsninger med hensyn til at løse den årtier lange kontrovers om den vigtigste cellulære kilde til skumceller. Disse data fremhæver den unikke indsigt, som nye teknikker giver, men opfordrer også til forsigtighed ved fortolkning af disse og andre undersøgelser og antyder, at yderligere udforskning af celleidentitet og -egenskaber ved hjælp af streng lineage tracing sammen med scRNAseq og avancerede proteinniveauanalyser er et afgørende område for fremtidig forskning.

Wang et al anvendte lipidfiksering efterfulgt af BODIPY (bor-dipyrromethen) farvning og flowcytometri til at forsøge at kvantificere og karakterisere skumceller i aterosklerotiske aortas fra vestlig diæt-fodrede eller aldrende ApoE-/- mus. En lignende teknik blev anvendt af Kim et al16 til at isolere BODIPY+ SSChi skumceller fra aterosklerotiske murine aortas til analyse ved hjælp af single cell RNAseq. Det er vigtigt, at begge undersøgelser analyserede hele aortaer og ikke læsioner, således at størstedelen af de analyserede celler ikke stammer fra aterosklerotiske læsioner i sig selv, men snarere afspejler de samlede populationer af celler i læsioner, medier og adventitia. Desuden fokuserede Kim et al. på sorterede CD45+ celler for at profilere makrofagpopulationer i murine aorta, hvilket naturligvis ville have udelukket de SMC-afledte skumceller, der er beskrevet af Wang et al. Gruppen inkluderede scRNAseq-data om alle BODIPY+SSChi skumceller i supplementet. Det er interessant, at disse data viser celler, der er positive for ACTA2 og Sm22a, hvilket kunne være de ikke-leukocyt-afledte skumceller, som Wang et al. beskrev i deres undersøgelser. Det er dog vigtigt, at scRNAseq-resultater måske ikke er en pålidelig metode til kvantificering af skumcellers oprindelse, fordi Winkels et al fandt beviser baseret på bulk RNAseq-dekonvolution, at standard scRNAseq-teknikker underprøver makrofager og monocytter med ≈65%.17 Dette kan være en væsentlig årsag til, at grupper, der er særligt interesserede i makrofagpopulationer, ville være nødt til at koncentrere disse celler ved hjælp af flowcytometri før analyse, en teknik, der er fulgt i flere nyere artikler, der beskriver leukocytter i aterosklerotiske blodkar.16-18 Sådanne fremgangsmåder vil dog sandsynligvis kompromittere scRNAseqs potentielle styrke til at påvise celletype-diversitet og opdage betydningen af tidligere ukendte cellepopulationer i sygdom. Faktisk gælder vores forudfattede fordomme ikke kun for celleinput, men også for fortolkning af scRNAseq-data, hvor investigatorer får et helt transkriptom af aorta- eller læsionscellepopulationer og derefter fortsætter med at navngive celletypen baseret på brugen af nogle få, velkendte markører. Dette modarbejder formålet med en teknologi, der er beregnet til at adskille grupper baseret på hundreder eller tusinder af gener, og kan også føre til forvirring for grupper, der studerer lignende cellepopulationer.19,20 Sidstnævnte spørgsmål er særlig problematisk i betragtning af den nu veletablerede upålidelighed af brugen af nogle få konventionelle og velkendte markørgener til at identificere celletyper i sene stadier af aterosklerotiske læsioner.5,9-11 Wang et al. erkender faktisk, at 20 % af ikke-SMC skumcellerne heller ikke udtrykker CD45, hvilket indikerer, at de kan stamme fra en anden kilde eller fra makrofager, der ikke længere udtrykker CD45. Ingen teknik er helt uvildig, og derfor må brugen af flere komplementære teknikker, herunder lineage tracing, immunohistokemisk farvning, flowcytometri, CyTOF og sekventering være guldstandarden for fremtidige undersøgelser, der undersøger celleidentitet i åreforkalkning.

En uklarhed i celleidentifikation baseret på brug af et eller kun få markørgener kan også have kritiske terapeutiske implikationer. Det vil sige, at en behandling, der kan have gavnlige virkninger på nogle celler, kan have skadelige virkninger på andre celler. Dette er klart illustreret i en nyere Nature Medicine-artikel fra vores gruppe21 , som uventet viste, at investering og fastholdelse af SMC i den fibrøse kappe i avancerede aterosklerotiske læsioner er afhængig af IL-1b- og IL-1-receptor-signalering. Derimod er det også veletableret, at IL-1b bidrager til udviklingen af åreforkalkning.22 På samme måde blev ABCA1 (ATP-binding cassette A1) vist af Wang et al. at være nedreguleret i CD45-negative skumceller, hvilket forfatterne foreslår kan være en mekanisme for deres ophobning af lipider over tid. Måske er de subtile forskelle i celletypers evne til at reagere på plaque-mikromiljøet afgørende for læsionspatogenese, da celletyper i det forkerte job bliver fanget. Vi postulerer faktisk, at SMC-afledte makrofaglignende celler er dårlige substitutter for professionelle fagocytiske celler og ender med at blive opslugt af lipid, men har en begrænset kapacitet til at bortskaffe det (figur).

Sammenfattende giver de heri rapporterede undersøgelser af Wang et al. en vigtig forbindelse mellem observationer af skumceller i humane læsioner og musemodeller og tyder på en undervurderet rolle for SMC i skumcelledannelsen. Konklusionerne af Wang et al. giver overbevisende beviser for, at der er behov for meget mere forskning på dette område. Forhåbentlig kan vi ved kombineret brug af avancerede lineage tracing-modeller i mus og uvildig transkriptionel og proteomisk profilering af læsionsceller mere præcist definere oprindelsen og funktionerne af de forskellige celletyper, der findes i læsioner, og udvikle nye effektive terapeutiske metoder til at forbedre plakkens stabilitet og reducere de sene trombotiske komplikationer af åreforkalkning.