FALSRAPPORT

En 5-årig dreng blev diagnosticeret med akut lymfoblastisk leukæmi i december 1994 og indgik i Fralle 93-protokollen. Barnet opnåede hæmatologisk remission 6 uger efter, at induktionskemoterapi blev indledt. Han blev set som ambulant patient og reagerede godt på behandlingen i de følgende år. Ved en konsultation i marts 1997 fik patienten imidlertid en feberepisode, da han blev perfunderet med Port-a-cath-systemet. Den kliniske undersøgelse viste ingen septisk lokalisation. Leukocyttallet var 10 860/ml med et absolut neutrofiltal på 8 850/ml. Der blev indsamlet et sæt blodkulturer fra Port-a-cath-systemet, og den aerobe flaskekultur gav gulpigmenterede kolonier af gram-positive coryneforme stænger. Drengen fik ceftriaxon (1 g) intravenøst én gang, efterfulgt af cefadroxil 500 mg to gange om dagen i 7 dage. På grund af vedvarende feber blev cefadroxil givet i endnu en uge, og de immunosuppressive lægemidler blev afbrudt i samme periode. Patientens anamnese var ubemærket i de næste 2 måneder, og der blev ikke foretaget nogen bloddyrkning, da han kom til sine månedlige besøg. I juni 1997 blev barnet præsenteret til konsultation som subfebril og klagede over træthed. En fysisk undersøgelse afslørede ikke noget infektionsfokus, og leukocyttallet var ikke forhøjet. Der blev taget et sæt blodkulturer fra Port-a-cath’en, og den aerobe flaske viste de samme gram-positive coryneforme stænger, der senere blev identificeret som Microbacterium sp. Der blev diagnosticeret kateterrelateret bakteriæmi, og det centrale venekateter blev fjernet. Ampicillin (100 mg/kg/dag) blev givet intravenøst perioperativt, idet den første dosis blev givet 24 timer før operationen. Patientens kliniske tilstand forbedredes hurtigt herefter. Port-a-cath’en blev dyrket på Columbia blodagar. Inden for 24 timer ved 37 °C var der vokset en renkultur af gulpigmenterede kolonier af en ikke-fermentativ, gram-positiv, noget misfarvet stang. Desværre gik subkulturerne tabt, og der kunne ikke foretages yderligere undersøgelser.

Den stamme, der blev isoleret fra patientens blodkulturer, mærket CF36, var en gulpigmenteret, bevægelig coryneform med et oxidativt stofskifte, proteolytisk aktivitet og cellulære fedtsyrer af den forgrenede type. Disse generelle træk tyder på slægten Microbacterium, som omfatter både fermentative og oxidative arter, sidstnævnte tidligere kaldet Aureobacterium (13).

Den 16S rRNA-gen (rDNA) sekvens blev undersøgt ved at bruge et sæt primere til amplifikation. PCR-produkterne blev renset fra agarosegel med et QIAquick gelekstraktionssæt (Qiagen, Westburg, Nederlandene). Sekvensanalysen blev udført med en 3100 automatisk DNA-sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Californien) ved hjælp af ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-kittet. Hver sekvens blev sammenlignet med de sekvensdata, der er tilgængelige i databaser, ved hjælp af BLAST (10). Et fylogenetisk træ blev konstrueret ved hjælp af neighbor-joining-metoden (8, 11).

16S rDNA-sekventering baseret på 1.490 nukleotider af stamme CF36 afslørede de højeste lighedsniveauer på 99,5 % med sekvensen af M. luteolum DSM 20143T og 99,3 % med sekvensen af M. oxydans DSM 20578T. Den var også nært beslægtet med sekvenserne af M. saperdae (99,2 %) og M. liquefaciens (99,1 %) (Tabel (Tabel1).1). Fire andre lignende stammer blev indsamlet fra forskellige prøver fra andre patienter, der blev mærket CF7 isoleret fra en blodkultur, CF34 fra et bronkialaspirat, CF130 fra en blodkultur og CF40 fra en ukendt menneskelig kilde. Yderligere en stamme, CF128, blev opnået fra en vegetabilsk prøve. De fem stammer viste 16S rDNA-sekvenser, der lignede typestammen af M. oxydans, fra 99,3 til 99,4 %, mens deres lighed med CF36 var fra 99,9 til 100 %. Ni andre kliniske isolater udviste 99,9 til 100 % lighed med typestammen af M. oxydans.

Disse resultater fik os til at foretage en omfattende undersøgelse af de følgende seks stammer: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 og CF130.

Cellulære fedtsyrer, bestemt som tidligere beskrevet (14), viste den samme profil i alle stammer. De gennemsnitlige procentdele af de vigtigste cellulære fedtsyrer var som følger: 40,3 % anteiso-C15:0 (interval, 37,1 til 46,0 %), 27 % anteiso-C17:0 (interval, 22,9 til 31,3 %), 15,7 % iso-C16:0 (interval, 13,8 til 19,3 %), 9,3 % iso-C15:0 (interval, 4,6 til 13,9 %), og 4,2 % iso-C17:0 (interval, 3,0 til 7,2 %).

Analyse af CF36- og CF7-cellevægpeptidoglykan blev udført ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Tyskland) af N. Weiss med en tyndtlagskromatografimetode som beskrevet af Schleifer og Kandler (12). Peptidoglykanet var af B2β-typen med d-ornithin som diaminsyre.

DNA-DNA-hybridisering blev udført af P. Schumann ved DSMZ som beskrevet af De Ley et al. (3) med de modifikationer af Escara og Hutton (4) og Huss et al. (7). DNA-homologiprocenten for CF36 med M. luteolum LMG 16207T var kun 33,7 %, og den med M. oxydans DSM 20578T var 46,6 %, men der blev opnået høje niveauer af DNA-slægtsskab på henholdsvis 78,1, 81,8 og 78,2 % med stammerne CF7, CF34 og CF40. Dette var i overensstemmelse med, at de blev henført til en enkelt art. G+C-indholdet i stamme CF36 DNA var 69,9 mol% som bestemt på DSMZ.

De seks stammer var gram-positive, bevægelige, coryneforme stave. De voksede godt på Columbia blodagar ved 37°C, og farven på kolonierne var gul. Stammerne var strengt aerobe, katalasepositive og oxidase negative. De var i stand til at hydrolyserer esculin og gelatine. Selv om 16S rDNA-sekventering viste tætte slægtskabsforhold til M. luteolum, M. saperdae og M. liquefaciens, var disse arter fænotypisk ret forskellige. Ingen af dem voksede ved 37 °C, M. luteolum og M. liquefaciens var ikke bevægelige, og M. luteolum og M. saperdae var ikke proteolytiske. Disse resultater er i overensstemmelse med data i litteraturen (2). Stammernes fænotypiske egenskaber lignede mest M. oxydans’ egenskaber. Glukose blev oxideret syrnet på phenolrød agar med lavt peptonindhold (15). Alle stammerne voksede ved 40 °C, mens ingen af M. oxydans-isolaterne var i stand til at vokse ved denne temperatur. Desuden blev salicin ikke syrnet, i modsætning til M. oxydans. De nye stammer kunne også adskilles fra M. oxydans ved hjælp af API 50CH-assimilationsstrips (bioMérieux). Laktose blev udnyttet, og 2-ketogluconat blev ikke udnyttet, mens M. oxydans havde de modsatte reaktioner. Når API ZYM-strips (bioMérieux) blev anvendt, adskilte negative reaktioner for esterase lipase (C8), α-chymotrypsin og β-glucosidase de seks stammer fra M. oxydans. Fænotypiske karakteristika, der differentierer de nye stammer fra beslægtede oxidative, bevægelige, proteolytiske Microbacterium-arter, der vokser ved 37°C, er rapporteret i TabelTabel22.

Antibiotikafølsomhed blev testet på Mueller-Hinton agar med E-teststrimler (PDM, Solna, Sverige). MIC-områderne (mikrogram pr. milliliter) var som følger: penicillin, 1,5 til 2; ampicillin, 1 til 1,5; cefotaxim, 3 til 6; cephalothin, 16 til 24; ciprofloxacin, 1 til 1,5; gentamicin, 2 til 3; vancomycin, 3 til 4; clarithromycin, <0,016.

Fænotypiske, kemotaksonomiske og genetiske undersøgelser tyder på, at de seks undersøgte stammer tilhører slægten Microbacterium, men udgør en ny art, for hvilken navnet Microbacterium paraoxydans foreslås, og som er nært beslægtet med M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum og M. liquefaciens (Fig. (Fig.11).

Så få rapporter omhandler isolering af Microbacterium-arter fra klinisk materiale. De fleste blev oprindeligt henført til CDC-gruppe A-4 eller A-5, og selv nyere isolater blev sjældent identificeret på artsniveau (1, 5, 6, 9). Kun i et lille antal tilfælde viste isolatet sig at være det sygdomsfremkaldende agens for infektionen. Et tilfælde af endophthalmitis forårsaget af en Microbacterium blev rapporteret af Funke et al., og på grundlag af 16S rDNA-sekventering blev stammen anset for at tilhøre en ubeskrevet art (6). I en undersøgelse af Microbacterium spp. fundet i kliniske prøver blev flere stammer identificeret som M. arborescens og M. imperiale, men der blev ikke foretaget nogen genetisk bekræftelse (5). Der blev rapporteret om et nosokomielt udbrud af Microbacterium-relateret bakteriæmi hos kræftpatienter, men den sygdomsfremkaldende organisme blev ikke identificeret til artsniveau. Et centralt venekateter var den vigtigste risikofaktor i denne undersøgelse (1). For nylig blev der rapporteret om to tilfælde af kateterrelateret Microbacterium-bakteriæmi, som blev identificeret ved 16S rDNA-sekventering. Det ene isolat var i 99,4 % af tilfældene relateret til M. oxydans, og det andet var i 98,7 % af tilfældene relateret til M. trichothecenolyticum, men der blev ikke opnået formel identifikation på artsniveau (9).

Stamme CF36 blev isoleret fra patientens blodkulturer med flere ugers mellemrum, og selv om den organisme, der blev isoleret fra det fjernede kateter, kun delvis kunne identificeres, er det sandsynligt, at den gentagne bakteriæmi var kateterrelateret, hvilket bekræfter, at intravaskulære katetre udgør en risikofaktor for infektion med disse organismer. Deres oprindelse kan være patientens hud, men da mikrobakteriernes naturlige levested er det livløse miljø, kan det ikke udelukkes, at forurenet perfusionsvæske har sat frø i patientens kateter.

I løbet af de seneste årtier har vi indsamlet 30 Microbacterium-isolater af human oprindelse på vores laboratorium. Alle disse stammer blev identificeret ved hjælp af en række fænotypiske og kemotaksonomiske karakteristika og ved 16S rDNA-sekventering. M. oxydans var langt den hyppigst isolerede art og tegnede sig for ca. en tredjedel af stammerne (9 ud af 30), efterfulgt af M. paraoxydans (5 stammer); M. aurum og M. lacticum var hver repræsenteret med 4 stammer. De resterende otte stammer var spredt over flere arter, med et M. foliorum-isolat, et M. schleiferi-isolat, et M. testaceum-isolat og fem isolater, der ikke passede til nogen beskrevet art.

Selv om mikrobakterier sjældent er involveret i sygdomme hos mennesker, er antallet af relevante isolater, der findes i nosokomielle omgivelser, stigende. Selv om mere end 30 arter er blevet anerkendt i slægten, er det sandsynligt, at kun et begrænset antal af dem er isoleret fra kliniske prøver. En mere præcis identifikation af humane isolater kan hjælpe os til bedre at forstå, hvilke arter der er tilbøjelige til at blive opportunistiske patogener.