I 1775 vendte Biddle tilbage til Nordamerika for at tilbyde sine tjenester til staten Pennsylvania i modstanden mod det britiske styre. Med udbruddet af den amerikanske revolutionskrig satte Pennsylvanias sikkerhedskomité Biddle under kommando af den bevæbnede galease Franklin. I december 1775 blev Biddle indlemmet i den kontinentale flåde og blev kaptajn på den 14-kanoners brig Andrew Doria.

Biddle deltog i ekspeditionen mod New Providence og kæmpede i den kontinentale flådes kamp mod HMS Glasgow den 6. april 1776. Biddle var meget kritisk over for aktionen og bemærkede, at kommandør Esek Hopkins’ manglende signalering førte til en “helter skelter”-aktion. Biddle skulle senere kapre adskillige skibe, herunder britiske hærtransporter, på senere krydstogter.

Biddle deltog senere i et krydstogt i Newfoundland Banks, der var så vellykket med hensyn til at kapre skibe, at da Biddle vendte tilbage til havn, havde han kun fem matroser tilbage om bord på sit skib; resten besatte de præmier, der var taget under krydstogtet.

Den 6. juni 1776 blev Biddle udpeget af den kontinentale kongres til at kommandere Randolph, en 32-kanoners fregat, der på det tidspunkt blev bygget i Philadelphia. Hun blev søsat ved årets udgang og sejlede ud i begyndelsen af 1777. I september 1777 erobrede Biddle HMS True Briton og hendes konvoj med tre skibe.

Den 7. marts 1778, ud for Barbados, angreb Randolph det britiske 64-kanoners linieskib HMS Yarmouth. I stedet for at forsøge at flygte fra den tungere bevæbnede modstander, engagerede Randolph sig i kampen for at beskytte en amerikansk handelskonvoj. Et øjenvidne rapporterede, at fregatten holdt stand i den tyve minutter lange kamp og så ud til at “affyre fire eller fem bredsider mod Yarmouth’s en”. Efter at Biddle var blevet såret, sprang Randolph pludselig i luften og dræbte alle undtagen fire af de 305 ombordværende, herunder Biddle. Tabet af Randolph var et alvorligt slag for den nyoprettede kontinentale flåde. Hans lig gik tabt på havet og blev aldrig fundet.

Hans bror, Edward Biddle, var en trofast fortaler for amerikansk uafhængighed, og hans nevø, Nicholas Biddle, var en anset bankmand.

Fire skibe i den amerikanske flåde har fået navnet USS Biddle til ære for ham.

Cyrus Townsend Bradys bog For Love of Country er delvist baseret på Nicholas Biddles liv.