Synonymer

Non-esterificerede fedtsyrer (NEFA), frie fedtsyrer, umættede fedtsyrer

Fysiologi

Non-esterificerede (“frie” eller umættede) fedtsyrer (NEFA’er) er den vigtigste bestanddel af triglycerider (fedtlagrene i kroppen), som består af tre fedtsyrer bundet til en glycerolryggekæde. Hos sunde dyr (når de spiser eller ikke er i energimangeltilstand) stammer NEFA’er hovedsagelig fra nedbrydning af triglycerider, der indtages med kosten gennem chylomikroner (lipoproteinlipase frigør NEFA fra chylomikronrester). Under fasteforhold eller tilstande med negativ energibalance er hovedkilden til NEFA imidlertid hydrolyse af fedtlagre i kroppen.

Hydrolyse af lagrede triglycerider (fedt) i fedtvævet ved hjælp af hormonfølsom lipase frigør NEFA og glycerol. Hormonfølsom lipase (som findes i adipocytternes cytosol) stimuleres af forskellige hormoner, herunder glukagon (som frigives fra α-celler i pancreasets små øer som reaktion på lavt glukoseindhold) og kortikosteroider. Når NEFA’er er frigjort fra fedt eller chylomironer, kan de anvendes som energikilde af mange væv, herunder skeletmuskulatur og hepatocytter. I hepatocytter varierer deres skæbne afhængigt af energibehov, hormonbalance og substrattilgængelighed, dvs. de kan anvendes til energiproduktion (via Kreb’s cyklus), pakkes om til triglycerider og eksporteres som lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL) eller lagres i leveren som triglycerider (som i overskud kan forårsage hepatisk lipidose) eller omdannes til ketoner.

Metodologi

Den primære metode til måling af koncentrationen af NEFA’er i serum er en kolorimetrisk enzymatisk metode, som er den metode, der anvendes på Cornell University.

Reaktionstype

Blanked end-point-reaktion. Blanking mindsker virkningen af hæmolyse på NEFA-koncentrationerne.

Procedure anvendt ved Cornell University

I første trin af denne tretrinsreaktion katalyserer acyl-CoA-syntetase (ACS) acyleringen af NEFA’er til (coenzym A) CoA, hvilket resulterer i dannelsen af acyl-CoA. Derefter dannes hydrogenperoxid ved oxidation af acyl-CoA gennem den katalytiske virkning af acyl-CoA-oxidase (ACOD). Endelig giver hydrogenperoxid i nærværelse af peroxidase (POD) mulighed for oxidativ kondensation af 4-aminoantipyrin med 3-methyl-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-anilin (MEHA), hvorved der dannes et blåviolet slutprodukt med et absorbansmaksimum ved 550 nm. NEFA-koncentrationen er direkte proportional med den målte optiske tæthed af farvestofproduktet.

Reaktioner er vist nedenfor:

NEFA+ ATP + CoA acyl-CoA synthesase > Acyl-CoA + AMP + pyrofosfat

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidase > 2,3-trans-Enoyl-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipyrin + MEHA-peroxidase > blå-lilla kompleks+ 3H2O

Måleenheder

Koncentrationen af NEFA’er måles i mEq/L (konventionelle enheder) eller mmol/L (SI-enheder). Enhedsomregningen fås ud fra følgende formel:

mEq/L x 1= mmol/L

Proveovervejelser

Prøvetype

Serum eller EDTA-plasma. Serum/plasma skal adskilles fra cellerne hurtigst muligt efter opsamlingen, og serumet/plasmaet skal anbringes i et separat rør. Tilsvarende anbefales ikke corvac-rør (serum-separator-rør), da værdierne er lidt (men signifikant) højere i disse rør sammenlignet med ikke-antikoagulerende (rød top) rør.

Anticoagulerende

EDTA. Værdierne er mindre stabile i heparin, som også giver højere baselinekoncentrationer end EDTA eller serum, og NEFA-værdierne stiger ved opbevaring (Stokol og Nydam 2005).

Stabilitet

Stabil i kvægserum eller EDTA-plasma ved 4°C i 72 timer. Stabilt frosset i kvægserum i 1 måned (-70°C). Værdierne stiger inden for 24-48 timer efter opbevaring ved 24°C i serum eller EDTA-plasma. NEFA-koncentrationerne stiger hurtigt i heparin efter opbevaring. (Stokol og Nydam 2005).

Anbefalinger til prøveudtagning hos overgangsmælkekøer

• Antikoagulant: Rød top (serum) eller lilla top (EDTA). Undgå heparin (grøn top) og corvac (serumseparator) rør.
• Håndtering: Separeres fra celler hurtigst muligt, opbevares køligt for at minimere falske ændringer i resultaterne (NEFA’er er særligt ustabile), indsendes hurtigst muligt til laboratoriet.
• Tidspunkt for indsamling: Prøver af køerne tages, når de kommer ind i fodringsboksene (se nedenfor).
  • Prepartum NEFA’er: Indsaml prøver fra køer 2-14 dage før kælvning.
  • Postpartum NEFA’er: Indsaml prøver fra køer 3-14 dage i mælk. Måling af både postpartum NEFAs og BHB udføres i en overgangsko-energiprofil til vurdering af energistatus hos lakterende køer på Clinical Pathology Laboratory i Cornell University.
• Antal køer: Der bør udtages prøver fra mindst 12 dyr pr. besætning til testning på besætningsniveau (testbeskrivelse i afsnittet om testfortolkning nedenfor). Der kan være tale om en blanding af kvier og >2 parente køer.
• Poolede prøver: Sammenlægning af individuelle prøver fra køer for at vurdere en besætnings energistatus anbefales IKKE. Undersøgelser på Cornell University har vist, at resultater fra puljeprøver er mindre følsomme end prøver fra individuelle køer (mindst 12 dyr pr. besætning), når der anvendes NEFA før eller efter fødslen til påvisning af overdreven negativ energibalance hos overgangsmælkekøer.

Interferencer

• Lipæmi, icterus: Ukendt virkning (sjælden hos kvæg).
• Hæmolyse: Afhængigt af den metode, der anvendes af laboratoriet, vil hæmolyse enten sænke eller øge NEFA-værdierne. Ved den blancherede metode, der anvendes på Cornell University, vil alvorlig hæmolyse (hæmolytisk indeks > 800 enheder) medføre et let fald i NEFA-koncentrationerne i kvægblod. Lipæmiske og ikteriske interferenser påvirker ikke NEFA-koncentrationen væsentligt med de metoder, der anvendes ved Cornell University.
• Eksponering/øvelse/stress: Disse forhold, som inducerer katekolamin- eller ACTH-frigivelse, øger NEFA-koncentrationerne ved at stimulere lipolysen gennem hormonfølsom lipase. Disse forhold bør minimeres, når der indsamles blodprøver til NEFA-måling.
• Tidspunkt for prøveudtagning: NEFA-værdierne er sandsynligvis højere hos køer, der kommer ind til daglig fodring (sandsynligvis med en vis grad af negativ energibalance), end hos køer, der lige er blevet fodret (lipolysen vil være hæmmet hos disse sidstnævnte køer). Det anbefales at indsamle data lige før fodring.

Testfortolkning

NEFA-testning foretages for det meste hos malkekvæg for at afgøre, om besætningen befinder sig i en for stor negativ energibalance. Den anvendes mere som en test på besætningsniveau end på individuelt dyrs niveau, og resultaterne fortolkes i forhold til en grænsekoncentration eller en procentdel af dyr med værdier over grænseværdien versus værdier over den øvre referencegrænse. NEFA-måling kan foretages på alle andre dyrearter som en markør for overdreven negativ energibalance. Dette foretages hyppigst hos kamelider (som udvikler hepatisk lipidose under disse omstændigheder), andre drøvtyggere (f.eks. geder, får) for at afgøre, om de er i risiko for ketose, og heste (med metabolisk syndrom hos heste). Bemærk, at koncentrationer under referencegrænsen ikke er klinisk relevante.

Forhøjede koncentrationer

• Fysiologisk: Træning inducerer frigivelse af katekolaminer og ACTH, som stimulerer den hydrolytiske aktivitet af hormonfølsom lipase for at fremme fedtmobilisering for at opfylde overskydende energibehov. Denne proces øger koncentrationen af NEFA’er i blodet.
• Racemæssige forskelle: Flere undersøgelser har vist, at NEFAs er lavere hos Jersey-køer efter fødslen end hos Holstein-køer, hvorfor retningslinjer, der er udviklet til Holstein-køer (se nedenfor), muligvis ikke kan anvendes på Jersey-køer (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Negativ energibalance hos malkekøer: Mælkekøer i den periparturiente periode (overgangsperiode) er altid i en tilstand af negativ energibalance på grund af det høje energibehov fra fosteret under udvikling og mælkeproduktionen (især med vægt på udvælgelse af høj mælkeproducerende køer). Denne negative energibalance kan imidlertid være for stor, og de berørte køer er i risiko for gastrointestinale (forskudt gummer), metaboliske (klinisk ketose) og infektiøse (f.eks. metritis) sygdomme i den tidlige postpartumperiode. Derfor overvåger mælkeproducenter ofte malkekvægsbesætninger for overdreven negativ energibalance ved at teste for NEFA’er, enten alene hos køer før eller efter fødslen eller som en del af en metabolisk profil hos køer efter fødslen. Resultaterne af disse test kan fortolkes på individuelt ko-niveau (dvs. at en NEFA-værdi over en bestemt grænseværdi indikerer en for høj negativ energibalance) eller på besætningsniveau (dvs. at en andel af de testede køer har NEFA-værdier over en bestemt grænseværdi). Identifikation af overskydende negativ energibalance hos individuelle køer (og endnu vigtigere) i besætningen viser, at der er behov for ændringer i ernæringen (f.eks. forøgelse af foderpladsen i sengebåse, forøgelse af energitætheden i rationen) og for at reducere energibehovet og stress for overgangskøer. Følgende retningslinjer for fortolkning er baseret på undersøgelser foretaget på Cornell University og gælder for prøver indsamlet fra TMR-fodrede Holstein-køer “i risiko” mellem 2-14 dage før kælvning (præpartum NEFA’er) eller 3-14 dage efter kælvning (postpartum NEFA’er). Vi anbefaler, at der tages prøver fra mindst 12 “risikokøer”, når man evaluerer besætninger med total blandet ration (TMR) for subklinisk ketose (Ospina et al. 2013).
  • Prøver på kvægniveau
    • Prepartum NEFA’er: Der er en øget forekomst af sygdomme efter kælvning (forskudt gylp, metritis/tilbageholdt placenta og klinisk ketose), nedsat mælkeydelse og nedsat reproduktionsydelse i de første 30 dage i mælk hos Holstein-mælkekøer (fodret med TMR) med NEFA-værdier > 0,30 mEq/L, når de testes 2-14 dage før kælvning.
    • Postpartum NEFAs: Der er en øget forekomst af sygdomme efter kælvning (forskudt gylp, metritis/fastholdt placenta og klinisk ketose), nedsat mælkeydelse og nedsat reproduktionsydelse i de første 30 dage i mælk hos Holstein-mælkekøer (fodret med TMR) med NEFA-værdier > 0,60-0,70 mEq/L, når de testes 3-14 dage efter kælvning. I Cornell-undersøgelserne var NEFA’er efter kælvning faktisk en bedre forudsigelse af end β-hydroxybutyratkoncentrationer efter kælvning eller NEFA’er før kælvning.
• Test af besætningsniveau
  • Prepartum NEFA’er: På besætningsniveau er der en signifikant øget risiko for metaboliske og infektiøse sygdomme efter kælvning, nedsat mælkeproduktion eller nedsat reproduktionsevne, hvis >15% af de testede køer før kælvning har NEFA-værdier > 0,30 mEq/L. Bemærk, at som anført ovenfor, anbefales det ikke at samle prøver fra individuelle køer til testning på besætningsniveau.
  • NEFA-værdier efter fødslen: På besætningsniveau er der en signifikant øget risiko for metaboliske og infektiøse sygdomme efter kælvning, nedsat mælkeproduktion eller nedsat reproduktionsevne, hvis >15-20% af de testede køer efter kælvning har NEFA-værdier > 0,70 mEq/L. Bemærk, at som anført ovenfor anbefales det ikke at samle prøver fra individuelle køer til testning på besætningsniveau.

Hepatisk lipidose hos malkekvæg: I en undersøgelse havde et NEFA:kolesterol-forhold >0,2 (SI-enheder) en odds ratio på 9,9 for, at et dyr havde hepatisk lipidose (defineret som >10% lipidindhold i leveren), idet denne grænseværdi var mere følsom (63% med 85% specificitet) end BHB, NEFA alene eller AST-aktivitet (>120 U/L) til diagnosticering af hepatisk lipidose (baseret på arealet under den modtageroperationskarakteristiske kurve eller AUC). Dyrene i denne undersøgelse fik dog foretaget blodmålinger på forskellige tidspunkter efter laktationen (Mostafavi et al. 2013).

Negativ energibalance hos smådyr: Dette forekommer primært ved diabetes mellitus. I en tilstand af insulinmangel eller insulinresistens går hæmningen af hormonfølsom lipase tabt. En regulerende ubalance af den hormonfølsomme lipaseaktivitet øger fedtmobiliseringen fra fedtvævet til levervævet, hvilket øger koncentrationen af NEFA’er.

Negativ energibalance hos kamelider: Syge, stressede kamelider, især drægtige hunner, er i risiko for at udvikle hepatisk lipidose. Måling af NEFA kan foretages for at afgøre, om de befinder sig i negativ energibalance. Kamelider med NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist et al. 2001) har en øget risiko for lipidose. Anorektiske kamelider har ofte NEFA’er, der er forhøjet, men under denne værdi, og de udvikler måske ikke lipidose.